可注射透明质酸羟基磷灰石复合材料的理化特性

随着年龄增长，面部透明质酸(hyaluronan，HA)流失、真皮胶原蛋白减少引起面部松弛、皱纹等生理性衰老问题。这些问题一定程度上可通过可注射性软组织填充材料予以改善和解决。已上市的填充材料主要分为两类：可降解生物材料，如胶原蛋白、HA 等；以及不可降解生物材料，如硅胶、聚丙烯酰胺等。

可注射交联 HA 产品凭借其优良的亲水性、生物相容性、无免疫原性、生物可降解性等优良性能成为了目前市场上应用最广泛的软组织填充材料之一。HA的强亲水性可以为肌肤带来补水效果，以1,4-丁二醇二缩水甘油醚(1，4-butanedioldiglycidyl ether, BDDE)作为交联剂制备得到的交联HA 能在一定程度上延长材料在体内的保留时间(约6个月)，但由于人体内存在对应的HA酶(HAase)，所以可注射 HA 填充材料仍然存在体内停留时间短、降解速率过快的问题，需定期注射填充剂方可保持良好的面部年轻化效果，不仅造成经济负担，还存在一定的安全风险。

羟基磷灰石(Hydroxyapatite，HAP），化学组成为 Ca10(PO4)6(OH)2，是构成人体骨骼的主要无机成分。因其优良的生物相容性和骨传导性，HAP现已被广泛用于人体骨组织的修复。同时，HAP对细胞合成、分泌胶原等细胞外基质有一定的促进作用。用HAP和其他高分子材料复合制备成的具有生物活性、半永久乃至永久塑形作用的生物材料，近年来倍受医美材料领域的关注。

2006年通过美国FDA认证上市的可注射性填充材料“RADIESSE®”(微晶瓷)就是一种含约30% HAP(直径25~45µm)颗粒的可注射羧甲基纤维素(CMC)凝胶医美产品，对成纤维细胞增殖、胶原基质的再生具有促进作用，且在体内保留的时间得到有效延长(约12个月)，弥补了其他材料(胶原、HA)注射周期短的问题。

HA和HAP均是人体内天然存在的物质，材料本身具有良好的生物安全性，以其为原料制备的植入材料具有刺激结缔组织中成纤维细胞分泌并构建细胞外基质的潜力。复合材料中的HAP颗粒为无机材料，若与HA复合有可能提高填充材料的硬度和弹性，提高材料的塑形能力和抵抗酶降解性能。

因此，基于HA和HAP两种材料的特点，四川大学研究人员设计并制备了一种负载HAP 的可注射HA复合水凝胶。以 BDDE作为交联剂在碱性条件下交联 HA，形成三维网状结构，从而均匀包裹 HAP颗粒。研究制备了HA-HAP复合水凝胶并对其主要的理化性能作了表征，对细胞相容性作了初步评价， 证明了其可以满足植入器械的基本要求，有望作为面部填充材料。

HAP颗粒由四川拜阿蒙生物活性材料有限责任公司提供，粒径范围在 25~40 µm；HA(平均分子量1380kDa)购自山东福瑞达医药集团公司；交联剂BDDE购自北京百灵威科技有限公司。

称取一定质量的HA充分溶解于0.8% NaOH(pH=12.99)溶液中，配制得到重量比10%的HA溶液。在特定条件下，HA分子中的伯羟基可以与交联剂BDDE的两个环氧基团发生开环交联反应。根据HA与BDDE的基本反应原理，两者完全反应时BDDE的理论完全反应当量是equivalent 1.0。按照表1所示的参数计算并在搅拌下依次加入一定量的HAP颗粒和BDDE。样品按 HAP颗粒及BDDE用量(当量数)， 分别标记为HA-1.0、HAP15-0.5、HAP30-0.5、HAP30-1.0、HAP45-1.0。

首先进行灭菌稳定性观察，高温高压的灭菌过程会造成部分HA分子链发生断裂，导致水凝胶内部结构或者外部形态发生改变。为探究所制备材料的灭菌稳定性，本实验采用高温蒸汽灭菌法(121℃ , 15min)考察了灭菌后凝胶的形态变化。

由于复合水凝胶中残留的交联剂和碱性成 分可能会对其性能产生明显影响，因此为了更显著 地观察到两种因素对水凝胶灭菌后稳定性的影响差异，本研究在已完全透析的复合水凝胶中人为添加过量(10wt%)的交联剂和碱液以进一步明确特定残留物对灭菌稳定性的影响：取HAP45-1.0透析完全后的样品，分别加入10%的BDDE或10%的0.8%NaOH溶液作高温蒸汽灭菌，观察灭菌前后复合水凝胶的形态与稳定性变化。

研究进行的实验部分还包括流变性能测试、样品内部形貌观察、推挤力测试、溶胀性能和体外稳定性测试、体外降解行为测试、体外细胞培养形态观察和增值测试。

制备过程透析完成后，根据水凝胶的质量增加量可得其吸水量，从而计算得到透析后各组水凝胶中HA与HAP的百分含量，表2给出了5组凝胶样品透析前后的HA和HAP含量的变化。从表中数据对比可见，交联剂BDDE的使用量(当量数)和 HAP初始含量对复合水凝胶的吸水溶胀过程均有影响。

由HAP30-0.5、HAP30-1.0组可知，BDDE用量越高(1.0eq)，水凝胶的交联度越高，交联水凝胶的三维网状结构越紧密稳定，越能限制水分子的进入，所以透析后水凝胶吸水量降低，HA含量较高。

由HA-1.0、HAP30-1.0、HAP45-1.0组可知，凝胶中HAP 的固有含量越高，水凝胶内部填充更紧密，水分子可以自由通过的空间更有限，同时HAP自身带有极性，静电作用和界面效应使得HAP在水溶液环境内可以在分子表面形成一层固化水层，抑制了水分子的扩散，从而大量分散在水凝胶内部的HAP颗粒表面形成了固化水层，抑制了外部水分子的自由进入，从而减少了水凝胶的吸水量，使得最终的HA 和HAP含量都相对较高。因此，改变 HAP的负载量和HA交联度对凝胶的溶胀性能有明显影响，可以通过HAP的含量和HA的交联度调控复合水凝胶性能。

作为一种天然高分子材料，HA分子柔软且不能耐受高温和辐照，而植入材料必须无菌，所以寻求不显著影响产品性能的灭菌方法和适宜的工艺条件是HA水凝胶商品化必须解决的问题，而交联反应是改善其灭菌稳定性的有效方法之一。由图2可知，本研究中透析完全后复合水凝胶采用常规灭菌参数达到完全灭菌的情况下，复合水凝胶的外观并无显著差异，稳定性较好；相比而言，未透析的复合水凝胶在灭菌后出现了变黄、降解。

未透析的水凝胶呈碱性且含有残留的BDDE，由HAP15-0.5、HAP30-0.5两组可知，在 BDDE用量不足时，参与反应的HA分子没有形成足够的交联密度，获得的水凝胶网络结构在高温条件下难以维持而被水解破坏，导致复合水凝胶样品中出现明显的固液分离；而HA- 1.0、HAP30-1.0、HAP45-1.0组材料灭菌后结构完好，表明三组凝胶交联程度较高且在高温下 能够较好地维持形态。

所以增加 BDDE的使用量， 提高HA交联度能够增强水凝胶的灭菌稳定性。此外，通过透析过程清除凝胶内部的碱性物质对于保证凝胶的灭菌形态稳定性十分必要。

医用注射填充材料对材料中的BDDE残留量有明确的限制，以保证植入材料的安全性。BDDE的热稳定性较差，在高温下易分解。由图3可知，如果复合水凝胶中含有较高含量的交联剂BDDE，在高温蒸汽灭菌过程中会破坏凝胶结构，负载在其中的HAP会有明显的沉降。

(图3)含残留交联剂的复合水凝胶灭菌后的形态

由图4可知，HA-1.0组水凝胶的储能模量(G’)与文献中采用类似参数的交联HA水凝胶结果相近(约为1750 Pa)，而HAP45- 1.0组水凝胶G’、 损耗模量(G”)均高于HA-1.0组。

储能模量表示黏弹性材料在形变过程中由于弹性形变而储存的能量，表明了HAP45-1.0组材料具有更强的弹性；损耗模量描述的是材料产生形变时能量转变为热能而损失的量度，HA-1.0、HAP45-1.0组损耗模量值相差不大，HA-1.0组略低表明该组材料黏性更大。

复合黏度(η) 反映了材料中的不同构成成分及分子间作用力大小，HAP45-1.0组材料由于凝胶内部含有大量的HAP颗粒，其分子间距离减小，作用力增大，黏度增大。两组材料在灭菌后储能模量和复合黏度降低，损耗模量未发生明显变化，表明灭菌过程会一定程度地破坏材料内部的分子网络结构，使其弹性减弱，而黏性变化较小。

由于材料储能模量远大于损耗模量，材料主要发生弹性形变，所以复合水凝胶整体仍更偏向于固态材料的力学性能。另外，采用BDDE交联的HA水凝胶比其它交联剂(二乙烯基砜DVS)能更好地提高水凝胶的流变性能。本研究中复合HAP后水凝胶表现出更高的储能模量，灭菌前后分别超过4000 Pa和3000 Pa。由此可见，采用 BDDE交联后的HAP-HA复合水凝胶不易发生形变，能更好地维持产品的形态，具有较好的可塑性。

空白HA水凝胶内部呈片状网状结构(图5)，孔径介于50~250µm，可能更有利于水分子或其它小分子通过；HAP-HA复合水凝胶中内部网络结构更为紧密，不同HAP含量的复合水凝胶样品中，HAP颗粒均分散均匀且被交联HA网络结构紧密包裹，具有较好的稳定性；HAP颗粒的粒径在 25~40 µm之间，由图可见HAP颗粒基本呈球形，尺寸较为均一且分散均匀。研究表明，HA水凝胶若具有更低的溶胀率、内部HA网络结构更紧密，则能更有效地限制酶或氧化性自由基的渗入，从而对HA的降解速率有减缓作用。所以结合HAP-HA 复合水凝胶的吸水性能以及内部形貌可以推断，该复合材料凭借其更低的溶胀率和更致密的内部结构，可展现出更优良的抗降解性和更长的体内保留时间。

结合上述实验结果，BDDE与HA反应程度越高，交联密度越大，形成的复合水凝胶结构稳定性越好，弹性越大，灭菌稳定性越好；HAP含量越高，复合水凝胶的吸水量越少，所以HAP45-1.0组材料 将可能表现出更优异的软组织填充性能。

图6分别为HA-1.0和HAP45-1.0两组材料的推挤力-行程曲线。HAP45- 1.0复合水凝胶平行样之间的推挤力差异不大且较平缓，说明除灌装时有少量小气泡外，材料均匀性较好， HAP颗粒分散均匀。HA- 1.0水凝胶推挤力约在(32.3士0.5)N，而HAP-H复合水凝胶在(217.0士2.5)N。两组材料推挤力差异较大，说明HAP颗粒对水凝胶的可注射性能影响较大，HAP 固含量越高，相互作用力越大，复合材料的推挤力越大。

(图6)水凝胶的推挤力-行程变化曲线

高分子水凝胶的溶胀行为一方面与水凝胶中高分子链的亲、疏水性和舒展状态有关系，另一方面也受高分子网络稳定性的影响，因此复合水凝胶的溶胀性能是其作为可注射性填充材料的一个关键评价指标。复合水凝胶质量溶胀率和体积溶胀率随溶胀时间的变化曲线(图 7A)中，质量溶胀率与文献报道值(约 45%)接近；图7B显示复合水凝胶在溶胀8 h时的形态与溶胀前保持一致，轮廓清晰。

本研究中，溶胀平衡时复合水凝胶的质量溶胀率和体积溶胀率分别达到51.65%、78.66%。由此表明，该复合水凝胶表现出良好的亲水溶胀性能，将有利于细胞和其它亲水性生物小分 子扩散、渗透进入水凝胶网络，有利于组织更好地识别、利用并进一步改造植入物。

由溶胀曲线可见，复合水凝胶浸泡1 h时质量已经达到平衡溶胀率的93.90%，而体积溶胀率为68.34%，表明复合水凝胶中亲水性良好的HA和HAP能从周围环境中快速吸收水分并达到质量稳定。而复合水凝胶中的高分子网络由于受交联而不能快速舒展平衡，导致体积溶胀相对滞后，这将为临床使用该类材料时提供参考。

如图7C，HAP45-1.0组材料在磷酸缓冲溶液(PBS)中 37℃条件下浸泡1、7和14 d后依旧保持完整的形态结构，表明复合水凝胶具有较高的稳定性，可塑性较好，在溶液环境内不易发生形变。鉴于BDDE交联的HA水凝胶和HAP颗粒经临床证实均具有良好的安全性与有效性，所以本研究制备的以物理形式复合的HAP-HA水凝胶材料在快速达到溶胀平衡状态后，也具有良好的安全性，且能够长时间、稳定地起到体内填充效果。

在120U/mL的HAase作用下，HA 的降解率随着酶解时间的延长而逐渐上升(图8)。在酶最适反应条件下，酶与底物接触的初期，由于底物比表面积较大，HAase能够快速渗透进入材料空隙并与降解底物接触，所以凝胶降解速率较快(15min)；随后降解逐渐减缓，降解率缓慢增长之后逐渐趋于平衡，最终在酶解3h内达到近70%的降解，并引起复合水凝胶的溃散。

血管栓塞是 HA 类软组织填充材料在临床应用时出现较为严重的并发症之一，一旦发现血管栓塞就须及时注射高浓度HAase(1500 U/mL)， 以快速降解HA水凝胶从而疏通血管。采用1500 U/mL的酶降解HAP45- 1.0复合水凝胶，2 min后的HA降解速率为234.9µg/min，降解率高达95.4%，远高于在120 U/mL酶浓度下的降解率，可以使复合水凝胶快速溃散。

据文献报道，人真皮下神经丛小动脉直径为100~400 µm，视网膜小动脉平均直径为(141.6±18.6)µm，小静脉平均直径为(209.3±26.1)µm，而市售常见的HA 填充剂颗粒直径为 20~1000µm，平均为185~250 µm。本研究中采用的HAP粒径在25~40µm，与现有的HA填充剂颗粒相比更小。

成纤维细胞分别在HAP45-1.0、HA-1.0材料上培养1、4和7d时，用FDA/PI染色，在 CLSM下观察显示(图9)，HA虽然具有极好的亲水性，但并不利于细胞的粘附，所以成纤维细胞在HA-1.0水凝胶中的粘附不理想，该组材料的表面未观察到粘附的成纤维细胞。相反，HAP45-1.0组材料中由于含有HAP颗粒，为细胞提供了大量的粘附位点，使得细胞在复合水凝胶表面明显粘附且具有良好的增殖趋势。由此可见，成纤维细胞在HAP45-1.0组  材料上贴附生长良好，且细胞密度日渐增长，未见细胞死亡后细胞核被PI染为红色的死细胞。表明HA-HAP复合水凝胶细胞相容性良好，能为细胞的粘附、增殖提供良好的微环境，更有利于细胞外基质的分泌和沉积。

进一步采用CCK-8试剂测定了成纤维细胞在HAP45-1.0和HA-1.0两组水凝胶材料中的增殖。由图10可知，成纤维细胞在HAP45-1.0组材料表面增殖良好，培养7d内始终处于增殖状态，且细胞数量显著高于HA水凝胶组；而在HA-1.0组细胞由于粘附不佳，细胞几无增殖。结合CLSM观察和CCK-8测定结果可知，复合水凝胶HAP45-1.0组材料没有细胞毒性，还能为成纤维细胞提供良好的生长微环境，促进成纤维细胞的增殖，使得细胞数量整体呈增长趋势，同时HAP颗粒的存在对后续的细胞外基质分泌和胶原的沉积具有潜在的促进作用。

本研究采用一步反应法制备得到了均匀负载HAP颗粒的HA-HAP复合水凝胶，经一系列分析和测定可得出如下结论：

1） 所制备的复合水凝胶经透析完全后均能够保持良好的灭菌稳定性。

2） 复合水凝胶中的HAP含量和交联程度对凝胶溶胀性能具有一定影响，通过该参数可以调控目标水凝胶的组成及溶胀行为。

3） HAP颗粒的引入能提高水凝胶的弹性、稳定性，使得复合水凝胶具有更好的可塑性，利于用作面部轮廓整形修正等软组织填充材料。

4） HAP颗粒还能提高复合水凝胶的细胞粘附性，为成纤维细胞提供适宜的生长环境，有利于后续的细胞外基质分泌，延长其体内停留时间，有可能促进组织修复或重建。

综上，与 HA 水凝胶相比，HA-HAP复合水凝胶凭借其较低的溶胀率、良好的力学性能、更好的细胞粘附性，在面部软组织填充领域可能具有更好的应用潜力。

全文参考文献：

1. 朱雨桐，谭佩洁，林海，朱向东，张兴栋．可注射透明质酸/羟基磷灰石复合材料：制备、理化性能和细胞相容性．无机材料学报. DOI:10.15541/jim20210020.

2. BAEK J, FAN YF, JEONG SH, et al. Facile strategy involving low-temperature chemical cross-linking to enhance the physical and biological properties of hyaluronic acid hydrogel. Carbohyd Polym, 2018,202: 545-553.

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