小核酸药物介绍
新冠疫情让同属核酸药物的mRNA获得了大众的广泛关注，也带动了小核酸药物的迅猛发展。尽管小核酸药物领域内目前仍有非常多的关键技术有待突破，但从全球市场发展来看，与传统的小分子化学药和抗体类药物相比，小核酸药物具有研发周期短、效果持久、研发成功率高、不易产生耐药性和治疗领域广等优点。
主要由于其高度依赖碱基互补配对原则，作用于基因转录和翻译过程，因此可从根源上调控致病基因的表达，并可达到单碱基水平上的特异性，同时可以解决某些疾病的蛋白靶点难以成药的问题。目前在治疗代谢性疾病、遗传疾病、癌症、预防感染性疾病等领域具有巨大潜力。
小核酸药物在2015年之前只有2款药物上市。1998 年，全球首款 ASO 药物 (反义寡核苷酸药物) Vitravene（Fomivirsem）批准上市；2013年Ionis公司的Mipomeren上市；2015年至今，已经有多项小核酸药物上市，适应症主要包括杜氏肌营养不良、肿瘤、囊性纤维化等各类疾病。
小核酸药物目前主要分为包括反义核酸（ASO）、小干扰RNA（siRNA）、微小RNA（miRNA）、小激活RNA（saRNA）、信使RNA（mRNA）适配体（aptamer）、核酶(ribozyme)、抗体核酸偶联药物（ARC）等，PNA(肽核酸)。
小核酸药物常见递送系统
递送方式与效率是小核酸药物能否进入细胞发挥作用的关键。小核酸药物进入细胞通常面临着两大挑战：
一是RNA暴露在血液中容易被血浆和组织中的RNase酶降解；
二是带负电的RNA难以跨膜进入胞内。
尽管不同的RNA疗法可能具有不同的作用机制，但它们都必须避免被非靶器官清除，必须进入正确的组织，而且不会引发有害的免疫反应。
按照不同递送技术分类，可以分为裸露RNA修饰递送技术、脂质体纳米递送技术、共轭连接递送系统（小分子配体、抗体及其他分子）和其他多种类型的新型递送系统（如多聚体纳米粒递送系统、细胞外囊泡递送系统等）。
其中，LNP和GaINac技术相对成熟；GaINac技术主要靶向肝脏，未来靶向其他器官的药物递送系统也有望突破。
LNP：脂质纳米粒（Lipid Nanoparticle）包裹核酸，使其靶向至目标细胞，并将特定基因的核酸递送至细胞内的方法
目前,LNP由结构脂质(模拟细胞膜并屏蔽正电荷)和聚(乙二醇)修饰脂质(防止LNP聚集和与生物环境发生不必要的相互作用)经典的LNP的脂质成分通常包括四种：可电离脂质(或阳离子脂质)、辅助脂质，胆固醇，聚乙二醇化脂质(PEG-脂质)。
GalNAc：基于N-乙酰氨基半乳糖修饰，并通过细胞内吞作用使药物进入细胞和发挥功能
小核酸的合成
小核酸药物的固相合成方法与固相合成多肽方法类似，都是采用固相载体，多肽固相合成经过脱保护、洗涤、偶联、乙酰化，经过多个循环得到目标肽，最后将肽从树脂上切割下来；小分子核酸固相合成脱保护、偶联、氧化、加帽循环。具体合成需要的树脂，偶联剂，原料等如下：
常用的固相载体为可控微孔玻璃珠（CPG）或者聚苯乙烯微珠（PS beads），固相载体通过linker与初始核苷酸核糖的3'-OH共价结合，而核糖的2'-OH用诸如叔丁基二甲基硅基(TBDMS)的保护试剂进行保护，或是核糖的2端有甲氧基、F代、甲氧乙基等修饰，5'-OH则用双甲氧基三苯甲基（DMT）保护。此外，由于腺嘌呤、鸟嘌呤和胞嘧啶存在伯氨基团，也需要用酰基试剂（例如苯甲酰基）进行保护。
固相合成每个循环主要包括四个步骤：脱保护、偶联、氧化和加帽。
第一步 脱保护（Detritylation）
使用溶解在二氯甲烷/甲苯中的二氯乙酸（DCA）或三氯乙酸（TCA）移除核糖5端的DMT基团，暴露5'-OH，以供下一步偶联。脱保护时间取决于流速和柱子尺寸，反应时间不够/脱保护剂酸性太弱会产生n-1杂质（与完整长度为n的寡核苷酸相比仅相差一个核苷酸）；反应时间太长/脱保护剂酸性太强则导致序列中脱嘌呤的产生。反应完成后，用乙腈洗涤去除残留的脱保护剂，此步骤中乙腈含水量一般小于20ppm，乙腈需要使用较高流速去冲洗合成柱，脱保护试剂冲洗不干净导致n+杂质的产生。
第二步 偶联（Coupling）
合成目标的原料，亚磷酰胺保护核苷酸单体，与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的3端被活化，5端羟基仍然被DMT保护，与溶液中游离的5端羟基发生偶联反应。为了保证较高的总产率，每个循环中都需要有较高的偶联效率。n-1杂质是偶联中最常见的杂质，它们是偶联效率低于100%的结果。与FLP相比，更高分子量的杂质（例如n+1）也存在于偶联步骤中，n+杂质的形成归因于活化剂四氮唑的弱酸性能移除一部分亚磷酰胺溶液中的DMT基团。
第三步 氧化（Oxidation）
偶联反应后新加上的核苷酸通过亚磷酯键（三价磷）与固相载体上的寡核苷酸链相连。亚磷酯键不稳定，易被酸、碱水解，在下一个循环的脱保护酸性环境中不稳定，因此需要被氧化成稳定的五价的磷。磷酸二酯键中的2-氰乙基保护基团可以使其在后续合成中更稳定。常用碘溶液将亚磷酰转化为磷酸三酯，得到稳定的寡核苷酸。此外通过将一个硫原子转移到P（三价）上也可以将其转化为P（五价），从而形成硫代磷酸酯键。氧化剂与固相载体的接触时间通常为1-4分钟。
第四步 加帽（Capping）
由于不可能达到100%的偶联效率，仍存在脱保护后没有反应的5'-OH活性基团（一般少于2%），如果不加处理，那这些基团在下一个循环中仍能发生偶联，产生n-1杂质。通常使用两种试剂（通常使用醋酸酐和N-甲基咪唑的混合液作为加帽试剂）来酰化5'-OH。
经过以上四个步骤，一个核苷酸碱基被连接到固相载体的核苷酸上，再以酸脱去它的5'-羟基上的保护基团DMT，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上去。
小核算药物的难点：
相比小分子药物，小核酸药物的杂质表征难度较大。小核酸药物在合成过程后会存在多种不同的的杂质，常见杂质包括缺失或增加序列的寡核苷酸、未完全去保护基团其色谱行为并不像普通小分子化药具有规律性，即使存在一些分析方法来对寡核苷酸分子量、分析序列、杂质等进行表征（下表），但是目前的手段其精确灵敏度还是存在很大改进空间。的产物、缺失嘌呤碱基的寡核苷酸以及其他降解产物。
小核酸药物与小分子和单抗相比，分子结构、作用靶标、半衰期、分布、代谢、DDI和免疫原性都存在较大不同，这给小核酸药物的非临床评价带来了极大的挑战。
小核酸药物往往要依靠化学修饰来降低体内的免疫原性，不同的修饰位点对药效、代谢、免疫反应、组织分布影响也不同，因此总的来说，小核酸药物不同产品的治疗原理、体内生物学行为、临床应用存在差别和不确定性。
加微信一起聊
