Blood月读 | 胡文青教授：探索Notch1在调节肝脏血小板生成素水平中的作用及其潜在机制

引言

血小板生成素 (TPO)主要由肝脏产生。TPO 水平在与 TPO 受体结合后可从循环中去除，导致内化和随后的破坏。衰老的和去唾液酸化血小板与肝细胞上的 Ashwell-Morell 受体 (AMR) 结合可刺激肝脏TPO的产生。

Notch信号通路高度保守，在许多发育过程和细胞功能中的细胞命运决策中起关键作用。在哺乳动物中，已经鉴定出4种Notch受体(Notch1-4)和5种配体(类Delta 1、类Delta 3、类Delta 4 [Dll4] 和 Jagged-1/2)。该通路通过Notch受体与配体的结合调节细胞间相互作用，引发Notch的蛋白水解裂解，释放Notch细胞内域，该内域随后转移到细胞核中调节基因转录和表达。在造血系统中，Notch调控巨核细胞生成和髓系祖细胞的细胞命运，但Notch/Delta4信号可能抑制巨核细胞的终末分化。但Notch是否控制肝脏TPO的产生仍不清楚。

Blood杂志上发表了一项题为“Notch1 regulates hepatic thrombopoietin production1”的研究，探索了Notch1在肝脏TPO产生中的作用。本文现将主要研究内容整理如下，以飨读者。

研究方法

该研究中Notch1^flox/flox小鼠(Notch1^fl/fl)模型是通过从Jackson实验室购得的Notch1小鼠与表达白蛋白启动子驱动Cre重组酶的转基因小鼠杂交，产生肝细胞特异性Notch1敲除小鼠(肝细胞[HC ]Notch1−/−)，敲除通过蛋白质印迹法验证。研究者使用酶联免疫吸附测定试剂盒和定量PCR检测小鼠肝脏中的TPO mRNA水平。通过尾静脉注射标记的抗体评估小鼠血小板半衰期，并连续五天施用外源性TPO进行分析。去唾液酸化血小板通过神经氨酸酶处理制备，用于实验。原代肝细胞通过灌注和酶处理分离，进行特定培养和实验处理。

研究结果

- 肝细胞 Notch1 缺乏症导致血小板减少症并降低 TPO 水平

研究发现，HC Notch1敲除小鼠肝脏超微结构和功能未见异常，肝功能指标正常。然而这些小鼠的外周血小板(图1A)和白细胞数量显著减少，但红细胞和血小板功能指标未见异常。骨髓造血细胞分析显示部分细胞类型减少，但血小板清除率和活化状态未受影响。

有趣的是，在通过腹腔注射抗血小板抗体诱导的急性血小板减少症模型中，HC Notch1−/−小鼠的血小板再生显著受到抑制(图1B)。与血小板减少症一致，HC Notch1−/−小鼠的血浆TPO 水平(图1C)和肝脏TPO mRNA水平(图1D)显著低于Notch1^fl/fl小鼠。这些结果表明，肝细胞特异性 Notch1 缺失减少了循环血小板的数量和肝脏TPO的产生，而不会影响肝功能。

图1 Notch1小鼠的血小板计数和TPO水平

- 肝细胞Notch1缺陷小鼠的巨核细胞成熟受损

鉴于HC Notch1−/−小鼠的TPO产生减少和血小板减少症，研究者评估了巨核细胞的成熟。结果发现这些小鼠的骨髓巨核细胞成熟受损(图 2A)，表现为成熟巨核细胞的数量减少(图 2B)和未成熟巨核细胞的数量增加(图 2C)。这可能是由于TPO水平降低，因为TPO 在巨核细胞的调节至关重要。进一步的实验显示，HC Notch1−/−小鼠的CD117+造血干细胞在体外能正常成熟和分化为巨核细胞，表明巨核细胞的异常成熟是由于TPO水平降低。外源性补充TPO促进了HC Notch1−/−小鼠中巨核细胞的成熟(图 2A)，并显著增加成熟巨核细胞(图 2B)和循环血小板的数量(图 2D)。

- Notch1缺陷肝细胞中JAK2和STAT3磷酸化降低

为探究Notch1调控肝脏TPO生成的机制，研究者对Notch1^fl/fl或 HC Notch1−/−小鼠肝脏进行RNA测序，发现266个上调基因和250个下调基因(图 3A)。KEGG (京都基因和基因组百科全书)分析显示，JAK/STAT 信号通路是这些失调基因中的主要通路之一(图 3B)，暗示其在Notch1缺陷小鼠中可能受损。RNA测序数据显示，Notch1−/−肝细胞的 JAK/STAT 磷酸信号传导被抑制，JAK2和 STAT3磷酸化降低(图 3C)。同时，Notch1−/−肝细胞中的TPO 蛋白表达显著降低(图 3C)，与TPO血浆和肝脏mRNA水平降低一致(图 1C、1D)。

据报道，血小板去唾液酸化能触发肝脏TPO的转录和翻译。研究者从Notch1^fl/fl或HC Notch1−/−肝脏中分离肝细胞，并确认无Kupffer细胞污染。用去唾液酸化血小板处理肝细胞后，Notch1^fl/fl肝细胞的JAK2/STAT3磷酸化和TPO产生增加，但在Notch1缺陷肝细胞中被抑制(图3D)，证实了Notch1在调节TPO产生中的作用。此外，Notch信号传导效应子HES5在Notch1缺陷肝细胞中表达降低，而HES1未降低(图3E)，暗示HES5可能参与TPO产生。在用去唾液酸化血小板处理的Notch1^fl/fl肝细胞中，HES5和TPO产生增加，Notch1激活增加，但在Notch1缺陷肝细胞中未见此现象(图3D)，这些数据表明，Notch1/HES5可能通过JAK2/STAT3信号传导调节肝脏TPO产生。

图3 Notch1^fl/fl或 HC Notch1−/−小鼠肝脏中的基因表达和信号通路差异

- 肝细胞 Notch1 缺失损害体内肝脏TPO的产生

以上结果表明Notch1信号在体外细胞培养系统中对肝脏TPO产生的作用。实验通过将去唾液酸化的血小板输注到Notch1^fl/fl或HC Notch1−/−小鼠中(图4A)。如图4B所示，输注去唾液酸化的血小板后，Notch1^fl/fl小鼠的肝脏TPO蛋白表达(图4C)显著高于HC Notch1−/−小鼠，同时HES5表达(图4D)和STAT3磷酸化(图4E)也增加。与较高的肝脏TPO蛋白表达一致，经过去唾液酸化的血小板处理后，Notch1^fl/fl小鼠的TPO mRNA水平也显著高于HC Notch1−/−小鼠(图4F)。这些结果进一步支持肝细胞Notch1在调控体内肝脏TPO产生中的作用。

尽管在体外实验中，去唾液酸化的血小板能刺激肝细胞产生TPO，但在体内受限于肝窦内皮屏障，小鼠血小板无法直接与肝细胞互动。但肝内皮的孔中存在肝细胞的微绒毛，可能允许血小板与肝细胞互动，库普弗细胞可以直接结合清除这些血小板。共聚焦显微镜分析显示，血小板位于肝窦中，无法穿过窗孔与肝细胞接触(图4G)，但在神经氨酸酶处理的小鼠肝脏切片中，去唾液酸化的血小板与肝细胞在肝窦内皮细胞与肝细胞的交界处共定位(图4G箭头)。大部分血小板附着在肝窦内皮细胞上，暗示其质膜可能有延伸部分，能穿过内皮窗孔与肝细胞互动。扫描电子显微镜显示，去唾液酸化的血小板表面有延伸的突起(图4H)，支持了它们通过这些突起与肝细胞直接互动的假设。这一假设还需进一步研究验证。

图4 TPO表达和血小板与肝细胞共定位

- HES5与JAK2/STAT3结合并促进其磷酸化

研究发现HES与 STAT3 的结合可调节Notch和 JAK-STAT信号，促进 STAT3 磷酸化及中枢神经系统发育。考虑到 HES5可能影响肝脏TPO生成 (图 3D-E)。HES5 是否能够与 JAK2 或 STAT3 结合并在它们在肝细胞中的激活中发挥作用。研究者通过免疫沉淀测定，发现去唾液酸化血小板处理促进了HES5与JAK2/STAT3和磷酸化JAK2/STAT3 的相互作用(图 5A)，表明HES5与JAK2/STAT3 结合可以刺激STAT3磷酸化和激活，导致肝脏 TPO 产生。

图5 JAK2/STAT3和HES5结合关系的分析图像

- Notch1与肝细胞中去唾液酸糖蛋白受体1(ASGR1)的关联

去唾液酸化血小板通过与肝脏Ashwell-Morell 受体(AMR)结合诱导TPO表达。免疫沉淀显示Notch1与AMR亚基ASGR1物理接近(图 6A)。Notch1缺失不影响ASGR1和ASGR2表达。阻断AMR或ASGR1显著降低Notch1信号(图 6C)、HES5表达(图 6D)、STAT3磷酸化(图 6E)和TPO产生(图 6F)，表明AMR结合促进Notch1信号激活和TPO生成。Kupffer细胞耗竭抑制去唾液酸化血小板诱导的TPO产生，提示其参与清除和TPO生成(图 6G、6H)，但具体协调机制尚待研究。

图6 Notch1信号通路调控肝脏TPO产生及AMR和Kupffer细胞的作用

- 血小板Dll4与肝细胞Notch1的结合激活Notch1信号传导

Notch1信号由配体Dll4与受体Notch1结合触发。假设去唾液酸化血小板结合AMR会促进Dll4与肝细胞Notch1结合(图 6A)，激活Notch1。但血小板表面Dll4蛋白水平未增加。阻断Dll4抑制Notch1激活及相关信号通路，减少TPO产生。体内实验也显示，阻断Dll4后，肝脏TPO产生受抑，支持Dll4刺激Notch1信号激活的观点。

研究结论

研究证明，Notch1 在肝脏 TPO 产生中的新调节作用，表明它可能是调节TPO水平的靶标

研究述评

该研究揭示了Notch1信号转导在肝脏TPO产生中的新调控作用，为血小板生成和调节提供了新的理解。通过对Notch1缺陷小鼠的研究，可以发现这些小鼠的血浆TPO水平和肝脏TPO mRNA水平显著降低，提示Notch1与JAK2/STAT3信号通路之间可能存在交互作用，这对于维持正常的肝脏TPO产生至关重要。这些发现不仅增进了我们对Notch信号在肝脏生理中作用的理解，还可能指导未来的临床研究，为治疗与血小板生成相关疾病提供新策略。此外，这项研究还强调了细胞外环境因素对肝脏TPO产生的影响，为开发新的治疗方法提供线索。未来的研究可以进一步探索Notch1与其他信号通路的相互作用，为疾病的预防和治疗提供更多的可能性。

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胡文青教授

副主任医师

北京大学国际医院 血液科副主任

社会任职：

- 中国抗癌协会血液肿瘤专委会委员

- 中国医药教育协会血液学专业委员会委员

- 北京癌症防治学会血栓与止血专业委员会委员

- 北京癌症防治学会红细胞疾病专业委员会委员

- 中国抗癌协会康复会血液分会委员

- 北京慢性病防治与健康教育研究会血液病专业委员会委员

参考文献：

1. Sun Y, Tong H, Chu X, Li Y, Zhang J, Ding Y, Zhang S, Gui X, Chen C, Xu M, Li Z, Gardiner EE, Andrews RK, Zeng L, Xu K, Qiao J. Notch1 regulates hepatic thrombopoietin production. Blood. 2024 Jun 27;143(26):2778-2790.