Cell Metabolism：肝脏的“钙”世奇缘

学术科学 2024-10-28 08:00 上海

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撰文 | 夏志蕊 王颖雯 朱丽君刘爽曹玉香

编辑 | 孟美瑶

校对 | 朱丽君

背景介绍

早在20世纪70年代就有报道描述了线粒体脱氢酶对钙的反应性，认为线粒体钙是线粒体氧化的几个调控节点之一。甘油-3-磷酸脱氢酶2(GPD2)、丙酮酸脱氢酶(PDH)、异柠檬酸脱氢酶(IDH)和α-酮戊二酸脱氢酶(OGDH)等酶可以催化三羧酸(TCA)循环的关键步骤，并调节细胞氧化还原平衡。在体外，这些脱氢酶的钙激活（小编注：当细胞处于静息状态、胞质内钙离子浓度较低时，线粒体钙离子摄入蛋白1 /2抑制钙通过线粒体钙单向转运体进入线粒体；而当细胞受到信号刺激、胞质内钙浓度升高并超过一定阈值时（约大于1 µM），线粒体钙离子摄入蛋白1 /2则允许钙通过线粒体钙单向转运体进入线粒体。钙与脱氢酶结合影响酶的结构进一步影响代谢酶对底物的亲和力，从而调节线粒体氧化过程）被证明可增加线粒体氧化活性和ATP消耗，说明线粒体钙在调节能量动力学中的关键作用。有学者提出，钙对线粒体脱氢酶活性的调节主要是为了精确和快速地满足机体对ATP的需求和消耗。
    线粒体钙单向转运体(MCU, mitochondrial calcium uniporter)是促进线粒体钙内流的单向转运体复合体(MCUC,Mitochondrial Calcium Uniporter Complex)(由MCU(Mitochondrial Calcium Uniporter)、EMRE(Essential MCU Regulator)、MICU1(Mitochondrial Calcium Uptake 1)和MICU2(Mitochondrial Calcium Uptake 2)组成)的组成成员之一，其通过调控线粒体钙在维持能量稳态中起作用。线粒体钙内流激活钙响应脱氢酶并增加线粒体氧化活性，研究表明当MCU敲除(KO)或敲低(KD)时，无法满足ATP的供需，会导致严重的代谢功能障碍和线粒体功能受损。虽然全身MCU KO的小鼠在某些背景下是胚胎致死的，但第一个存活的全身MCU KO小鼠在体外却并未如预期般出现严重的代谢障碍和线粒体功能受损，相反，全身MCU KO的小鼠仅仅表现出轻微的生理异常，如运动能力受损和通透性转换孔失调 (小编注：线粒体膜通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore, MPTP)是线粒体渗透转换功能的结构基础，由内膜和外膜的膜蛋白共同组成。它对细胞内多种离子浓度变化非常敏感, 特别是对细胞内信号传导系统有重要作用。膜通道孔的开放显著改变了线粒体的通透性。钙离子过度进入、线粒体谷胱甘肽的氧化和活性氧水平的增加等导致膜通道孔的持续开放，而造成细胞色素C的释放和线粒体膜电位的消失) 。
    尽管MCU在肝脏中的功能研究仍然有限，但最近有关代谢功能障碍相关脂肪变性肝病(MASLD)和2型糖尿病(T2D)治疗干预的最新进展也推动了对MCU的研究。由于胰高血糖素增加肝脏线粒体氧化和减少肝脏脂肪变性的作用，因此研究人员对胰高血糖素受体激动剂的兴趣重新燃起，特别是以胰高血糖素/GLP-1双重激动剂和胰高血糖素/GLP-1/GIP三重激动剂的形式。肝脏胰高血糖素受体激活肌醇三磷酸I型受体(IP3R-I)，其通过环磷酸腺苷(cAMP)和PKA激活诱导内质网钙释放和胞质钙积累，导致钙调素依赖性蛋白激酶II(CAMKII)(小编注：CAMKII是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，属于钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶亚家族。当钙/钙调蛋白(CAM)与CAMKII上的自催化位点结合，导致CAMKII的自磷酸化和完全激活，进一步激活下游靶标，在神经元发育、骨重塑、脂肪生成和全身葡萄糖稳态、破骨细胞生成和出生后肌生成中发挥重要作用)发生磷酸化，进而被激活。胰高血糖素除了促进丙酮酸羧化酶的变构激活来增加肝脏糖异生的经典作用外，还可以促进线粒体氧化，这主要是由于钙通过MCU从细胞质转移到线粒体，随后激活钙敏感的线粒体脱氢酶。然而，MCU在调节肝脏线粒体氧化中的作用尚未被专门研究，这对理解肝胰高血糖素的作用至关重要(小编注：胰高血糖素可以促进内质网钙流向线粒体和细胞质，而细胞质的钙离子通过MCU进入线粒体。本文发现敲除MCU后胞质钙上升，线粒体钙下降，但是依旧不影响线粒体氧化，说明线粒体钙上升是线粒体氧化的充分非必要条件，胞质钙可以通过CAMKII来促进线粒体氧化(。
    一般认为，钙通过MCU进入线粒体基质会促进线粒体氧化，而MCU的抑制或基因缺失会减少线粒体氧化。然而，近年来，这种观点变得越来越复杂。线粒体内膜蛋白(alalar、citrin、GPD2和短钙结合线粒体载体3[SCaMC-3])的钙结合位点暴露于线粒体膜间隙（小编注：alalar是由SLC25A12编码的钙结合线粒体载体蛋白，编码的蛋白质定位于线粒体，负责将天冬氨酸从线粒体转运到细胞质以交换谷氨酸，从而调节细胞内NADH水平；citrin是属于天冬氨酸/谷氨酸载体Aspartate/Glutamate Carrier, AGC)家族的线粒体内膜蛋白，主要功能是将线粒体内的天冬氨酸转运到胞质中，参与尿素、蛋白质和核酸的合成，将胞质中的NADH还原当量转移到线粒体中；GPD2是磷酸甘油穿梭系统的一部分，甘油-3-磷酸（G3P）可以进入线粒体，GPD2通过将其氧化成为二羟丙酮（DHAP）并将电子传递给FAD，从而生成FADH2，促进葡萄糖氧化），其中钙水平的波动近似等于细胞质，这说明细胞质钙在调节氧化磷酸化方面可能比线粒体钙发挥更大的作用。研究人员认为MCU和线粒体基质脱氢酶的钙活化对于约85%的氧化磷酸化是不必要的，他们阐明了一种依赖于胞质钙产生丙酮酸的机制，其通过激活线粒体的“油门踏板”——aralar而实现，并且独立于线粒体钙。
    由于研究技术的挑战性，先前关于线粒体内、外钙在线粒体能量调节的研究，其主要限制是缺乏这些体外研究结果的体内验证。近期，发表在Cell Metabolism上的一篇文章“Cytosolic calcium regulates hepatic mitochondrial oxidation, intrahepatic lipolysis, and gluconeogenesis via CAMKII activation”试图应用一种新的基于[¹³C₅]谷氨酰胺的代谢通量分析技术(Q-Flux)(小编注：Q-Flux是由Hubbard BT, LaMoia TE, Goedeke L, et al. 开发的一种评估体内肝线粒体琥珀酸脱氢酶、甲基丙二酰辅酶A变位酶和谷氨酰胺酶通量的方法，2023年发表在Cell Metabolism上的文章(DOI: 10.1016/j.cmet.2022.11.011)对这一方法进行了具体说明)来检测线粒体基质与线粒体外钙，在清醒状态下的肝脏特异性MCU敲除(MCU KO)小鼠中介导肝脏线粒体通量的贡献，结果发现线粒体钙减少和胞质钙增加。使用这种方法，研究人员发现尽管线粒体钙减少，MCU KO小鼠肝内线粒体脂肪酸氧化(FAO)率和线粒体总氧化率增加，导致肝脏脂质积累显著减少。此外，研究人员还观察到MCU KO小鼠肝内甘油三酯脂解率和丙酮酸羧化酶通量(V_PC)显著增加，并表明这些影响可归因于CAMKII介导的胞质钙激活。综上所述，这些数据表明线粒体氧化速率在体内不依赖于线粒体钙浓度。

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线粒体通透性过渡孔

        线粒体通透性过渡孔（Mitochondrial Permeability Transition Pore, MPTP）是位于线粒体内外膜上的一个多蛋白复合体，由细胞外膜的电压依赖阴离子通道（VDAC）、线粒体F/Fo合成酶（简称ATP合成酶）、线粒体内膜的腺嘌呤核苷转位蛋白（ANT）和亲环素D（CypD）等组成，对细胞内多种离子浓度变化非常敏感, 特别是对细胞内信号传导系统有重要作用。
        当Ca²⁺在线粒体基质中积累时，会触发线粒体内膜（inner mitochondrial membrane，IMM）性质的改变，使其具有渗透性和低选择性，从而允许各种离子和溶质重新分布，这种现象叫做线粒体通透性转变（mitochondrial permeability transition，mPT）。但需要注意的是，IMM是一个非常紧密的屏障，因此以上这些在线粒体内产生的信号分子和介质都需要一个专门的转运体来使其通过IMM——即MPTP。
        线粒体F1/Fo合成酶（简称为ATP合成酶）主要负责将IMM内的ADP和无机磷酸盐Pi转换为ATP，其主要由位于线粒体基质中的可溶部分F1（包括催化亚基α/β三聚体和调节亚基OSCP）和催化部分Fo（横跨IMM，包括c环结构和e/f/g亚基）组成。而ANT是一种线粒体转位酶，有三种亚型，分别为ANT1、ANT2和ANT3，能够将线粒体基质中的ATP与细胞质中的ADP进行交换；同时还存在两种构象——基质构象（m态）和胞质构象（c态），当其结合了ADP/ATP后，ANT会在c态和m态之间转换，在底物结合位点分别面向胞浆或线粒体基质时交换ADP/ATP，促进MPTP的开放或关闭。目前认为ATP合成酶以及ANT是mPTP形成的关键因素，主要是由于MPTP具有“多电导特性”，在低电导（振幅约0.3-0.7nS）情况下，质子、Ca²⁺、K+以及一些小代谢物（如谷胱甘肽）会被重新分配，主要参与生理条件下的线粒体变化；而高电导（振幅约1.5nS）情况下，IMM会允许通过更大的溶质（如蔗糖），从而对线粒体结构以及功能产生更大的影响，最终导致调节性细胞死亡。目前认为ANT是低电导情况下MPTP形成的主要相关蛋白，而高电导情况则主要与ATP合成酶有关，但是由于ATP合成酶与ANT存在密切的相互作用，目前尚不清楚这种相互作用是否涉及到孔形成机制和电导状态的确定。
        MPTP的开放会显著改变线粒体的通透性，导致参与生化反应的离子和代谢物重分配，任何在IMM上存在浓度梯度的离子都有可能被动地扩散到膜间空间，然后通过半透性的线粒体外膜（OMM）进入细胞质。线粒体基质中的钙离子外流主要和两个系统相关：线粒体Na+/Ca²⁺交换系统和线粒体H+/Ca²⁺交换系统。此外，MPTP的存在也为线粒体的Ca²⁺外排提供了另一种可能的途径，以此维持线粒体钙稳态。在低电导MPTP开放时，一些内源性的分子会排到细胞质中参与不同的生理反应，如从线粒体释放的ROS和α-酮戊二酸（α-KG）有利于干细胞的维持。而相反，高电导MPTP的持续和广泛开放会导致NADH耗竭，并诱导呼吸复合物的解聚，进而导致电子传递链的损伤，使ROS水平远远超过维持正常水平所需的量，损害线粒体功能和能量代谢。因此，MPTP对于线粒体功能的调节主要取决于其开放的时间和开放通道的选择。

参考文献：

[1] Bonora, M., et al. (2022). Nature reviews. Molecular cell biology, 23(4), 266–285.

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MCU KO小鼠的相关表型

MCU KO小鼠是由潘欣团队于2013年研究产生的基因敲除模型，被用于研究线粒体钙离子代谢和相关生理病理过程，并且首次在动物水平上揭示了线粒体钙的生理病理功能。

首先，MCU KO小鼠体型相对于MCU^fl/fl小鼠来说体型较小，器官重量与体重成正比。虽然MCU KO小鼠的线粒体钙摄取能力降低，但是该小鼠表型相对正常，基础代谢也未受到影响。线粒体内钙通常调节生物能量和代谢通量的关键线粒体酶，特别是钙敏感磷酸酶如PDP1（Pyruvate dehydrogenase phosphatase isoform 1），这种酶可以调节丙酮酸脱氢酶的磷酸化，从而降低其活性。在MCU KO小鼠中，由于线粒体基质钙水平较低而导致了MCU KO小鼠的骨骼肌表现出丙酮酸脱氢酶活性显著降低。因此，MCU KO小鼠剧烈活动的承受能力也随之降低。

参考文献：

[1] Pan, X., et al. Nature cell biology, 15(12), 1464–147.

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线粒体钙单向转运蛋白(MCU)

        线粒体钙单向转运蛋白复合体主要由成孔亚基MCU、MCUb、调节亚基、MICU家族和结构蛋白EMRE组成。其中，MCU和MCUb形成通道，MICU家族通过EF-hand结构域来感知钙离子的变化，并且经过一系列的构象变化后允许钙离子进入线粒体基质。
        首先，结构分析表明，成孔亚基线粒体钙单向转运蛋白（MCU）是一种高度保守的IMM蛋白，大小为40kD，MCU的N端和C端朝向线粒体基质。其C端结构域包括两个跨膜域（TM1，TM2）和卷曲螺旋结构域，这些结构域由一个膜间高度保守的含“DIME”基序的环连接(小编注：DIME 基序即为MCU的四聚体结构中MCU 通道孔的保守W-D-Φ-Φ-E-P-V-T-Y序列基序(其中D和E分别是人MCU中的Asp261和Glu264)，共同形成Ca²⁺选择性过滤器。而其N端结构域表面的MCU调节酸性贴片（MRAP，一簇负电荷残基）与二价阳离子结合，调节Ca²⁺摄取。
        目前大部分研究认为，MICU蛋白是线粒体Ca²⁺摄取的“看门人”，EF-hand结构域允许MICU蛋白在MCU通道门处感知Ca²⁺，并且根据膜空间的Ca²⁺浓度调节其打开。在低Ca²⁺浓度下，MICU通过二价键与MCU结合，使MCU保持关闭状态，防止Ca²⁺流入线粒体基质；而当EF-hand结构域感知到Ca²⁺浓度上升时，MICU与MCU分离，打开MCU。其次，MCUb虽然在结构上与MCU高度相似，但是却作为通道的负调节因子起作用，而EMRE通过GXXXG基序与MCU直接作用，主要介导MICU1/2的Ca²⁺感应门控，是MICU与MCU之间的钙信号传导器。MCUR1与MCU同样存在互作，其N端和C端都面向膜间空间，其下调影响线粒体Ca²⁺摄取和ATP产生，但是其在线粒体Ca²⁺摄取中的确切机制仍在争论中。

参考文献：

[1] D'Angelo D, et al. Biomolecules. 2023;13(9):1304.

[2] Carvalho EJ, Stathopulos PB, Madesh M. Curr Opin Physiol. 2020;17:197-206.

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胰高血糖素受体及其信号传导机制

        胰高血糖素受体属于B类G蛋白偶联受体家族，在维持人体血糖稳态中发挥关键作用。其它相关的G-蛋白偶联受体还包括胰高血糖素-样肽-1受体(GLP-I)、胰高血糖素-样肽-2受体(GLP-2)和胃抑制性多肽受体等。GCGR主要在肝脏和肾脏中表达，在心脏，脂肪组织，脾脏，胸腺，肾上腺，胰腺，大脑皮层和胃肠道中有少量发现。
        GCGR的天然配体为胰高血糖素。胰高血糖素由胰岛α细胞所分泌，是一个含29个氨基酸的直链肽。与胰岛素的作用相反，胰高血糖素是一种促进分解代谢的激素，促进葡萄糖异生和分解，抑制肝糖原合成，起着增加血糖的作用，主要靶器官为肝脏和肾脏。胰高血糖素的促糖异生作用和促线粒体氧化作用，首先要通过结合其受体激活Gas蛋白和Gq蛋白。一方面，Gas蛋白促进腺苷酸环化酶的活化，催化ATP转化为cAMP，随着cAMP水平的升高，蛋白激酶A（PKA）被激活，PKA可以直接磷酸化内质网膜上的钙离子通道，如肌醇三磷酸受体（IP3R）或者其他的内质网钙泵，促进钙离子从内质网向细胞质转运。另一方面，Gq蛋白激活磷脂酶C，进而产生肌醇三磷酸（IP3）和二酰甘油（DAG），IP3通过细胞质扩散并与内质网（ER）和肌浆网（SR）表面的IP3受体（IP3R）结合，通过结合其受体，同样可以促进内质网钙向胞质转运。值得注意的是，诸多细胞器并不是独立运转的，内质网和线粒体可以在细胞的特定部位发生偶联，它们的物理连接结构被称为线粒体相关内质网（Mitochondria Associated ER Membranes，MAMs）。因此，胰高血糖素通路促进了钙离子从内质网经MAMs转运到线粒体，促进线粒体氧化；而经内质网流向细胞质的钙离子，则主要通过MCU进入线粒体，参与线粒体氧化过程。
        此外，胰高血糖素通过刺激肌醇三磷酸受体1 (INSP3R1)激活肝脏脂肪甘油三酯脂肪酶（ATGL）、增加肝脏乙酰辅酶a含量和丙酮酸羧化酶的活性来增加线粒体脂肪氧化，促进肝内脂肪分解。同时CaMKII通过促进ERK1/2在Thr286位点的磷酸化激活，促使HSL在Ser563位点发生磷酸化促进脂肪分解，进而增加甘油三酯的水解而不是减少再酯化来增加脂解。

参考文献：

[1] Wilson, Chantell, et al. Cancer Epidemiology and Prevention Biomarkers 23.11 (2014): 2328-2337.

[2] Hilger, Daniel, et al. Science 369.6503 (2020).

[3] Rapold, Reto A et al. Journal of lipid researchvol. 54,1 (2013): 63-70.

[4] Perry, Rachel J et al. Nature vol. 579,7798 (2020): 279-283.

敲黑板啦！

1.肝脏MCU KO小鼠表现出胞质Ca²⁺积累和CAMKII的激活；
2.肝脏线粒体氧化不依赖于线粒体Ca²⁺；
3.CAMKII的激活是MCU KO小鼠肝脏线粒体氧化的主要原因；
4. MCU KO小鼠线粒体氧化的增加不依赖于aralar和SCaMC-3。

研究结果

肝脏MCU的缺失扰乱了胞质钙动力学

为了评估肝脏MCU在调节肝脏线粒体氧化、肝内脂肪分解(IHL)和糖异生中的作用，研究人员构建了肝脏特异性敲除MCU(MCU KO)小鼠模型，该模型是在C57BL/6J背景下，用flox/flox MCU小鼠(MCU^f/f)与肝细胞特异性Cre (Albumin-Cre)小鼠杂交产生。通过Western blot实验证实肝脏中MCU缺失(图1A)。在原代肝细胞里，研究人员证实肝脏MCU的功能缺失减少了ATP刺激的线粒体钙信号(图1B、C)。此外，MCU的缺失消除了线粒体钙缓冲能力，导致肝细胞在IP3R-I的激动剂胰高血糖素和抗利尿激素的刺激下细胞质钙的积累（小编注：正常情况下，细胞中的钙离子（Ca²⁺）稳态主要通过以下几个方面的机制来维持：1.细胞膜上的钙离子通道：细胞膜对Ca²⁺的低通透性，使得细胞内外Ca²⁺浓度存在巨大差异（细胞内约为0.1 μmol/L，细胞外约为1.0 mmol/L）。通过电压依赖性钙通道（VDC）和受体操纵性钙通道（ROC）等不同类型的通道，控制Ca²⁺的内流和外流，从而维持细胞内低钙浓度。2.钙泵（Ca²⁺-Mg²⁺-ATP酶）：细胞膜上的钙泵一方面负责将胞质中的Ca²⁺主动转运至细胞外，另一方面将胞质中的Ca²⁺储存至内质网和线粒体内，减少细胞质中Ca²⁺的含量，进而维持细胞内外Ca²⁺浓度梯度。3.Na⁺-Ca²⁺交换：通过Na⁺/Ca²⁺交换蛋白，细胞可以逆电化学梯度将胞质中的Ca²⁺转运到细胞外，进一步维持细胞内外的Ca²⁺浓度梯度。这些机制共同作用，确保细胞中钙离子的浓度维持在一个相对稳定的水平，从而支持细胞的正常功能）(图1D、E)。此外，研究人员进一步发现CAMKII的磷酸化在MCU KO小鼠的肝脏中显著增加(图1F、G)。综上所述，这些数据表明，肝脏MCU不仅可以调节线粒体钙内流，在维持细胞质钙动力学方面也具有关键的作用。

图1 肝脏MCU的缺失增加了细胞质内钙的积累

MCU缺失通过增加IHL和FAO减少肝脏脂质积累

先前的报道证实CAMKII活性与脂肪甘油三酯脂肪酶(ATGL)的磷酸化有关，重要的是，这些酶已被证明可以介导胰高血糖素增加IHL和FAO。因此，研究人员在MCU KO模型中评估了肝脏脂质代谢的变化。首先，研究人员通过western blot检测ATGL磷酸化，观察到MCU KO小鼠肝脏中ATGL的磷酸化显著增加(图2A)。同时研究人员测量了IHL的发生率，发现未经胰高血糖素刺激的MCU KO小鼠的肝脏切片中约95%的切片IHL发生率增加。胰高血糖素刺激使WT小鼠分离的切片中IHL增加，但胰高血糖素对MCU KO小鼠的IHL没有进一步增加(图2B)，同时研究人员也在原代肝细胞中重复了这一发现(辅图1A)。接下来，研究人员测量了从WT或MCU KO小鼠分离的肝脏切片中的[¹⁴C₁₆]棕榈酸酯氧化作为FAO的读数，并观察到与WT相比，约60%的MCU KO切片FAO读数增加(图2C)。通过对过夜禁食小鼠肝脏组织的生化分析，研究人员检测到肝脏长链酰基辅酶A(CoA)含量和乙酰辅酶A含量显著增加，与IHL和FAO的增加率一致(图2D、E)。此外，研究人员证实了这些影响是肝脏特异性的，而不是全身白色脂肪组织分解的增加（小编注：有文献报道，禁食条件下ATGL依赖的白色脂肪组织脂肪分解控制肝细胞PPARα活性，而肝细胞 PPARα控脂质分解代谢的基因的表达，说明脂肪组织脂解可能和肝脏中的脂解存在串扰）。循环三酰甘油(TAG)和非酯化脂肪酸(NEFA)浓度以及全身甘油周转率在WT和MCU KO之间没有变化，这表明肝脏MCU的缺失不影响全身脂肪分解(辅图1B-D)。尽管如此，研究人员观察到MCU KO的肝脏TAG和脂滴含量分别减少了约50%和30%(图2F-2H)，这些结果表明MCU 缺失改善体内肝脏脂质积累。

拓展阅读

肝脏切片（Liver Slices）

        肝脏切片代表了一种稳健且多功能的离体模型，它保留了肝脏环境的复杂和多细胞组织结构。是研究肝损伤机制和确定新治疗靶点的理想模型。具体方法：小鼠禁食过夜（16 h）并通过异氟醚吸入实施安乐死。收集肝脏并立即用冰冷的 KHB缓冲液（含110 mM NaCl、4.6 mM KCl、1.2 mM CaCl₂、2mM MgSO₄和1.4 mM NaH2PO₄）冲洗，然后利用空心圆柱形组织钻头用于制备直径为8 毫米的圆柱体组织芯。将组织芯切片插入支架，并用切片机切割至 250μm 厚，并保存在冰冷的 KHB缓冲液中，直到切片完成。
        对于葡萄糖生产和肝内脂肪分解测定，将一片切片与 0.25 mL 糖异生培养基（不含葡萄糖的DMEM培养基，45 mM NaHCO₃、0.5% 不含脂肪酸的 BSA、10 mM HEPES、20 mM 乳酸和 2 mM 丙酮酸）用于葡萄糖生成测定，或无血清低葡萄糖培养基（含 5.55 mM 葡萄糖、44 mM NaHCO₃ 的DMEM培养基，0.5% 不含脂肪酸的 BSA，10 mM HEPES）用于肝内脂肪分解测定。切片在 37°C 和 5% CO₂ 培养箱孵育6-8 小时，每 90 分钟对培养基进行一次采样。实验结束时，将切片在液氮中快速冷冻并收集培养基。立即测量培养基中的葡萄糖或甘油并归一化至冷冻组织重量。
        对于脂肪酸氧化测定，研究人员先将肝切片置于KRBB缓冲液（含 1.3 mM CaCl、25mM NaHCO₃、0.5%的不含脂肪酸的BSA，pH 7.4）中，并在35℃、70 rpm条件下孵育1小时。之后向缓冲液中加入100μM棕榈酸和0.2μCi/mL [¹⁴C₁₆]棕榈酸，在35℃、70rpm条件下孵育2小时。在孵育过程中，产生的¹⁴CO₂被捕获在含有NaOH（0.3 mL， 2M）的离心管中。孵育结束后，取出切片并在液氮中快速冷冻保存；通过闪烁计数器对吸收到NaOH溶液中的14CO₂进行定量，并归一化为冷冻组织重量。

图2 在MCU KO小鼠中脂肪酸氧化增加减少了肝脏甘油三酯积累

辅图1 全身脂解不受到肝脏MCU敲除的影响

MCU KO增加丙酮酸和谷氨酰胺回补，但是不增加HGP

考虑到肝脏特异性MCU缺失对降低肝脏脂质积累和增加肝脏乙酰辅酶A含量的显著作用，研究人员接下来使用Q-Flux来评估清醒状态下的WT和MCU KO小鼠的肝脏葡萄糖生成率(V_HGP)、丙酮酸羧化酶通量(V_PC)、PEPCK通量(V_PEPCK)和线粒体糖异生通量(V_{MITO GNG})。Q-Flux是一种基于[¹³C₅]谷氨酰胺的方法，利用质谱法测量TCA循环和糖异生过程中13C标签的稀释度，以评估体内关键肝脏线粒体通量的绝对比率。使用Q-Flux，研究人员发现与WT相比，MCU KO小鼠的肝脏V_PC、V_PEPCK和V_{MITO GNG}分别增加了约50%、45%和60%，这与乙酰辅酶A激活V_PC的结果一致(图3A-3C)。MCU KO小鼠肝脏线粒体代谢的这些显著变化与谷氨酰胺酶(V_GLS)催化的肝脏线粒体谷氨酰胺回补率增加约40%相关(图3D)。尽管丙酮酸和谷氨酰胺回补以及线粒体糖异生总量显著增加，但HGP的发生率在WT和MCU KO之间却没有变化(图3E)。在MCU KO小鼠中，来自甘油糖异生和糖原分解(V_GLY+GLYC/V_HGP)的HGP比例降低(图3F)，而来自线粒体糖异生(V_{MITO GNG}/V_HGP)的HGP比例增加(图3G)，所以整体V_HGP没有变化。
尽管肝脏V_PC、V_{MITO GNG}和V_PEPCK的比例增加，但为了解释V_HGP没有增加，研究人员评估了过夜禁食小鼠的血浆胰岛素浓度，发现MCU KO小鼠的血浆胰岛素浓度显著增加(图3H)。此外，在高胰岛素正常血糖钳夹期间(小编注：高胰岛素-正常血糖钳夹是指通过外周静脉灌注的方法，使受试者血清胰岛素水平上升到约100 muU/mL，并维持在这一水平。给予受试者20%葡萄糖的灌注，且使得血糖浓度维持在正常水平。高胰岛素-正常血糖钳夹方法可以用于评估外周组织对胰岛素的敏感性)，维持正常血糖所需的葡萄糖输注速率(GINF)显著增加，这可能是由于在高胰岛素-正常血糖钳夹期间，小鼠全身的胰岛素清除率降低(图3I)，从而导致血浆胰岛素浓度显著增加 (辅图2A-D)。同时，研究人员观察到MCU KO小鼠肝脏CEACAM1表达降低约46%(图3J) (小编注：CEACAM1是肝脏胰岛素清除的主要调节因子，其在胰岛素刺激下被胰岛素受体(INSR)磷酸化,从而促进胰岛素清除并调节肝脏脂肪生成)

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丙酮酸代谢与糖代谢

        丙酮酸不仅联系糖酵解途径、三羧酸循环和糖异生的的重要中间体，还在三大营养物质的代谢中起着重要的枢纽作用。首先，丙酮酸是细胞质中发生的糖酵解途径的最终产物。在缺氧条件下，丙酮酸在细胞质中乳酸脱氢酶（LDH）的催化作用下被NADH还原为乳酸和NAD⁺。在供氧不足时，大多数组织都能通过糖酵解途径生成乳酸。
        在氧气存在条件下，糖酵解产物丙酮酸能够进入线粒体经三羧酸循环彻底氧化分解同时产生大量能量。首先丙酮酸在有氧状态下能够通过扩散作用穿过线粒体外膜，进入膜间隙，再与位于线粒体内膜上的线粒体丙酮酸转运载体（MPC）结合，借助线粒体膜间隙的质子梯度以协同运输的方式和质子一起转运到线粒体基质中，进而被基质内的丙酮酸脱氢酶系（PDH）氧化成乙酰CoA，或在丙酮酸羧化酶催化下转化为草酰乙酸，进行三羧酸循环。线粒体丙酮酸通量的调节，产生的乙酰CoA会影响PDH催化活性，通过对各步骤的调控以确保持续的循环碳的进入和催化的碳排出，保持代谢循环通量的平衡。
        但当细胞能量充足时，乙酰CoA会抑制PDH活性，并别构激活线粒体基质中的丙酮酸羧化酶（PC），进一步在磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）催化作用下，丙酮酸转化为磷酸烯醇丙酮酸，在细胞质中进入糖异生途径，最终生成葡萄糖，调节血糖水平，进一步影响糖酵解途径。

参考文献：

[1] Gray LR, et al. Cell Mol Life Sci. 2014;71(14):2577-2604.

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甘油糖异生

糖异生底物包括乳酸、氨基酸和甘油等物质，脂肪细胞中甘油三酯通过脂解作用产生甘油并将其释放到体循环中，甘油通过水通道蛋白-9，一种细胞膜蛋白进入肝细胞。在肝细胞中甘油激酶将甘油转化为甘油-3-磷酸，甘油-3-磷酸在3-磷酸甘油脱氢酶的催化下变成磷酸二羟丙酮（DHAP），同时能够在磷酸丙糖异构酶（TIM）的催化下，将DHAP转变为糖酵解和糖异生的中间代谢产物甘油醛-3-磷酸（GAP）。甘油通过进入磷酸二羟基丙酮和甘油醛-3-磷酸的磷酸丙糖库进入糖异生途径。磷酸丙酮在醛缩酶的作用下生成1,6-二磷酸果糖，再由1,6-二磷酸果糖的不可逆催化反应下生成6-磷酸果糖，再变构为6-磷酸葡糖，最后由6-磷酸葡糖磷酸酶催化生成葡萄糖。

参考文献：

[1] Shah A, et al. Annu Rev Nutr. 2023;43:153-177.

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丙酮酸和谷氨酰胺的回补反应

丙酮酸和谷氨酰胺能够通过两种独立的方式生成三羧酸循环的中间代谢产物回补三羧酸循环，维持三羧酸循环的持续进行。
丙酮酸一个重要的回补反应是由丙酮酸经丙酮酸羧化酶催化生成草酰乙酸的反应。草酰乙酸是TCA循环中的一个重要中间产物，它与乙酰辅酶A结合生成柠檬酸，从而开始TCA循环。当草酰乙酸被消耗后，丙酮酸可以被用来补充其含量，确保TCA循环能够持续进行。这种回补机制在细胞中某些代谢物浓度不足或特定酶缺乏时尤为重要。丙酮酸还可以氧化脱羧转化为乙酰辅酶A，随后乙酰辅酶A再参与TCA循环。而谷氨酰胺则可以通过谷氨酰胺酶（GLS）催化生成谷氨酸，然后谷氨酸在谷氨酸脱氢酶（GDH）或者转氨酶（TAs）的作用下进一步转化中间产物α-酮戊二酸（α-KG），在TCA循环中发挥作用。并且当线粒体丙酮酸转运受损时，谷氨酰胺氧化可以维持TCA循环和细胞存活。谷氨酰胺还与丙酮酸的代谢相互关联，共同发挥作用。

参考文献：

[1] 王镜岩，朱圣庚，徐长法.生物化学(下册).北京:高等教育出版社，2002:63-8

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Q-Flux

Q-Flux一种基于质谱的技术，主要利用[¹³C₅]谷氨酰胺作为代谢示踪剂，用来评估体内关键肝线粒体通量的绝对速率。基于[¹³C₅]谷氨酰胺的方法Q-Flux(Q为谷氨酰胺单氨基酸缩写)是在同位素稳态下求解的一系列34个代数通量建模方程，建模广泛依赖于通过GC-MS和LC-MS/MS测量的前体和代谢产物的过量原子百分比(APE)的计算。并且进一步证实谷氨酰胺为合适的代谢通量分析(MFA)示踪剂。

小鼠Q-Flux方法：小鼠禁食 6 小时后，在轻柔将尾巴固定，然后进行连续输注[¹³C₅]谷氨酰胺 [6 μmol/（kg-min）] 或 [¹³C₄]天冬氨酸 [10 μmol/（kg-min）] 以及 [3-3H] 葡萄糖（0.1 μCi/min）持续 2 小时。每120分钟收集一次尾尖血，用于测定血浆葡萄糖、胰岛素和全身 HGP。所有小鼠均用静脉注射戊巴比妥钠注射液（150 mg/kg）麻醉，收集组织并立即在液氮中快速冷冻。

示意图中展示了两种激素刺激条件对TCA循环及相关代谢途径的不同影响，一方面在高胰高血糖素血症期间，其中高胰高血糖素水平激活cAMP-PK系统，参与广泛的磷酸化作用，磷酸化丙酮酸激酶使其失活，进而间接抑制TCA循环的进行，抑制糖代谢，增强了磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的效率促进糖异生，同时增加谷氨酰胺酶（GLS）通量、甲基丙二酰辅酶 A 变位酶（MUT）通量并促进甘油转化为葡萄糖。用于评估正向V_SDH，GLS和MUT通量变化。另一方面利用高胰岛素-正常血糖钳夹技术提高胰岛素水平，通过PI3K-Akt途径增加GLUT4（葡萄糖转运蛋白4）的细胞膜转位，促进葡萄糖的摄取，并激活PDH促进TCA循环，抑制糖异生，以更好地评估VS_DH（R）。其中红色代表被抑制的代谢步骤，绿色代表被促进的代谢步骤。

参考文献：

[1] Hubbard, et al. Cell metabolism. 35,1 (2023): 212-226.

图3 肝脏MCU KO增加了丙酮酸和谷氨酰胺回补，但损害了胰岛素清除率

辅图2 在高胰岛素血糖钳夹期间，肝脏MCU KO会损害全身胰岛素清除率

线粒体钙对于肝脏线粒体氧化不是必要的

有研究发现线粒体Ca²⁺对几种线粒体脱氢酶，特别是PDH、IDH和OGDH的变构激活已经得到了证实，这表明线粒体钙内流会促进线粒体氧化增加。研究人员在体外系统中已经观察到，由于线粒体Ca²⁺的抑制，MCU KO小鼠的线粒体氧化通量减少(图1B、C)。使用Q-Flux，研究人员测量了清醒状态下WT和MCU KO小鼠肝脏中的三种线粒体氧化率:IDH (V_IDH)，OGDH通量(V_OGDH)和琥珀酸脱氢酶(V_SDH(F))。令人惊讶的是，研究人员发现在MCU KO小鼠中，V_IDH、V_OGDH和V_SDH(F)通量分别显著增加了约60%、45%和50%(图4A-C)。V_IDH和V_OGDH本身对钙敏感，尽管线粒体Ca²⁺减少，但这些比率仍然增加。此外，MCU KO小鼠体内肝脏FAO(V_FAO）的绝对比率增加了约100%(图4D)，这与研究人员观察到的肝脏TAG浓度的降低一致(图2F)。总之，这些数据表明，尽管几种线粒体氧化酶对钙敏感，但线粒体氧化速率与线粒体钙内流并无太大关系。

图4 线粒体钙对于线粒体氧化不是必需的

CAMKII激活增加了MCU KO小鼠线粒体氧化和丙酮酸回补

上述实验结果表明，尽管线粒体Ca²⁺内流减少，但MCU KO小鼠的肝脏线粒体氧化代谢率增加。研究人员试图探究肝脏MCU缺失促进肝脏线粒体丙酮酸和谷氨酰胺回补、线粒体糖异生和线粒体氧化的机制。基于先前的报道，胞质Ca²⁺在调节线粒体氧化速率方面比线粒体Ca²⁺发挥更大的作用。因此，研究人员为了确定MCU KO后IHL、FAO、线粒体氧化和回补通量上调的原因是否是由于胞质Ca²⁺激活CAMKII，研究人员再次使用Q-Flux来评估用对照腺病毒或激活型CAMKII腺病毒(CAMKII- CA)处理的WT小鼠的肝脏氧化和回补通量率，以确定胞质Ca²⁺的积累和CAMKII的激活是否足以增加丙酮酸和谷氨酰胺回补、线粒体糖异生和线粒体氧化的速率。结果显示，CAMKII-CA的表达显著增加了WT小鼠的V_PC、V_PEPCK和V_{MITO GNG}通量(图5A-C)，与MCU KO小鼠的表型一致，这表明胞质Ca²⁺激活CAMKII可能是MCU KO促进肝脏线粒体丙酮酸回补和线粒体总糖异生通量增加的机制。同样，在表达CAMKII-CA的WT小鼠中，V_IDH、V_OGDH和V_SDH(F)均显著升高，再次证明了以上结论(图5D-F)。综上所述，CAMKII在MCU KO小鼠中的激活可能是导致线粒体氧化、丙酮酸回补和线粒体糖异生增加的关键步骤。

图5 MCU KO后线粒体氧化和丙酮酸回补是由于CAMKII的激活

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钙离子对线粒体氧化速率的独特调控作用

在静息状态下，细胞质内的钙离子浓度维持在很低的水平，大约为100 nM，大部分的Ca²⁺主要存储于内质网、肌浆网和线粒体中。但当细胞接受刺激时，细胞外的Ca²⁺内流和内质网/肌浆网中Ca²⁺外流，使细胞质中的[Ca²⁺]迅速升高，形成不同的钙信号，从而执行其所需的细胞功能。

线粒体是存储Ca²⁺的容器之一，它与内质网、细胞外基质等协同合作，共同维持细胞内[Ca²⁺]的平衡。细胞质[Ca²⁺]升高后，能够通过线粒体单向转运复合体穿过线粒体膜进入线粒体，线粒体Ca²⁺浓度增加通过别构调节的方式影响TCA循环的三种Ca²⁺敏感脱氢酶的活性（丙酮酸脱氢酶，异柠檬酸脱氢酶和α-酮戊二酸脱氢酶），并导致线粒体NADH/NAD⁺比率和ATP水平增加。此外，研究结果表明，除了通过线粒体单向转运复合体进入线粒体的Ca²⁺主要影响三羧酸循环脱氢酶的活性外，细胞质中的Ca²⁺也能够通过调节细胞质到线粒体的丙酮酸供应速率来适应线粒体氧化磷酸化（OXPHOS），通过苹果酸-天冬氨酸穿梭（MAS），线粒体外 Ca²⁺驱动丙酮酸的控制高达 85% OXPHOS ，线粒体内Ca²⁺占剩余的 15%。

参考文献：

[1] Szibor M, Gizatullina Z, Gainutdinov T, et al. J Biol Chem. 2020;295(14):4383-4397.

[2] Rieusset J. Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 2017;1864(6):865-876.

CAMKII 敲低(CAMKII KD)消除MCU KO增加的线粒体氧化和丙酮酸回补作用

基于以上发现，CAMKII的激活足以解释肝脏MCU KO对关键的肝脏线粒体通量的影响。接下来，研究人员试图确定抑制CAMKII是否会消除这些影响。因此，研究人员使用反义寡核苷酸(ASOs)敲低了MCU KO小鼠肝脏的CAMKII，并且敲低的是肝脏中CAMKII的两个主要亚型（CAMKIIδ和CAMKIIλ），然后使用Q-Flux在体内评估关键的肝脏线粒体通量。使用这种方法，研究人员实现了CAMKIIδ和CAMKIIλ ASOs处理的MCU KO小鼠肝脏中CAMKII表达降低约50%(图6A)。与WT小鼠相比，MCU KO小鼠的V_PC、V_PEPCK和V_{MITO GNG}均显著升高，但是CAMKII KD消除了这种影响(图6B-D)。此外，虽然MCU KO小鼠肝脏中的V_IDH、V_OGDH和V_SDH(F)显著增加，但这种影响同样被CAMKII KD消除(图6E-G)。这些研究结果表明，MCU KO增加丙酮酸回补和线粒体氧化的作用是通过CAMKII依赖的机制发生的，尽管线粒体钙内流减少，但CAMKII激活对于增加线粒体氧化是必需的。

图6 CMAKII KD消除了MCU KO增加线粒体氧化和丙酮酸回补的作用

MCU KO小鼠线粒体氧化的增加独立于aralar和SCaMC-3

先前的研究表明，体外MCU缺失导致细胞质钙的积累和钙敏感的谷氨酸-天冬氨酸转运体的激活，从而增加苹果酸-天冬氨酸穿梭活性。因此，研究人员试图在MCU KO小鼠中，探究aralar激活和苹果酸-天冬氨酸穿梭活性的增加是否也增加线粒体氧化。为了支持这一假设，研究人员发现，在MCU KO小鼠肝脏中，通过[乳酸]:[丙酮酸]比例测量的胞质氧化还原状态降低，而通过[β-羟基丁酸]:[乙酰乙酸]比例测量的线粒体氧化还原状态增加，这与苹果酸-天冬氨酸穿梭的激活一致（小编注：苹果酸-天冬氨酸穿梭的生理意义主要在于将NADH上的氢离子转入线粒体，促进线粒体氧化还原）(图7A、B)。为了评估这一潜在机制，研究人员在Q-Flux实验中同时输注氨基乙酸(AOA)，这是一种苹果酸-天冬氨酸穿梭的抑制剂，并预测如果aralar能促进MCU KO的影响，那么AOA会消除MCU KO小鼠线粒体氧化率的增加。结果显示，AOA恢复了MCU KO小鼠的细胞质和线粒体氧化还原平衡，表明AOA具有抑制苹果酸-天冬氨酸穿梭的效果(图7A、B)。尽管如此，研究人员发现急性AOA注射并没有显著改变V_PC(图7C)，也没有消除MCU KO观察到的氧化速率的增加(图7D-F)。综上所述，激活aralar和增加苹果酸-天冬氨酸穿梭活性对于MCU KO小鼠体内肝脏线粒体氧化的增加不是必需的。

此外，先前的研究表明，SCaMC-3是胰高血糖素激活线粒体氧化所必需的。SCaMC-3是一种线粒体ATP-Mg/Pi载体，在膜间隙有一个与aralar相似的钙结合结构域，对胞质钙敏感。因此，研究人员试图探究胞质Ca²⁺活化SCaMC-3是否可能在MCU KO小鼠线粒体氧化率增加中发挥作用。为了评估这个问题，研究人员用靶向肝脏腺相关病毒（AAV-shSCaMC-3）处理MCU KO小鼠，从而在体内敲低SCaMC-3(SCaMC-3-KD)，并用Q-Flux测量肝脏线粒体通量。尽管AAV处理使SCaMC-3表达减少了80%(图7G)，但在MCU KO小鼠中观察到的V_PC、V_IDH、V_OGDH和V_SDH(F)的增加并没有被SCaMC-3 KD所消除，实际上有随着SCaMC-3 KD而增加的趋势(图7H-K)。综上所述，这些数据表明，在MCU KO小鼠中观察到的线粒体氧化和丙酮酸回补的增加并不需要胞质Ca²⁺活化SCaMC-3。

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苹果酸-天冬氨酸穿梭

位于苹果酸-天冬氨酸穿梭体系中的第一个酶是苹果酸脱氢酶。苹果酸脱氢酶在该穿梭体系中有两种存在形式：线粒体苹果酸脱氢酶以及胞浆脱氢酶。两种苹果酸脱氢酶的区别在于他们的存在位置以及结构，并且在此过程中催化的反应方向相反。

首先，在胞浆中苹果酸脱氢酶与草酰乙酸以及还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）作用生成苹果酸以及NAD⁺。在此过程中两个氢原子产生自NADH并伴随着一个H+也结合到草酰乙酸上形成苹果酸。

一旦苹果酸形成，第一个反向转运体（苹果酸-α-酮戊二酸）将苹果酸从胞浆引入线粒体基质与此同时并将α-酮戊二酸从线粒体基质中导出到胞浆中。当苹果酸到达线粒体基质后，它被线粒体苹果酸脱氢酶转换成草酰乙酸，与此同时NAD⁺被其中的两个电子还原成NADH且氢离子被释放出来。草酰乙酸接下来被线粒体天冬氨酸氨基转移酶转换为天冬氨酸（因为草酰乙酸不能透过内膜进入胞浆）。生成天冬氨酸时需要由谷氨酸提供氨基，同时谷氨酸被同一个酶转化生成α-酮戊二酸。

第二个反向转运体（谷氨酸-天冬氨酸）将谷氨酸从胞浆引入线粒体基质与此同时将天冬氨酸从线粒体基质中导出到胞浆中。一旦进入胞浆，天冬氨酸被胞浆天冬氨酸氨基转移酶转变成草酰乙酸。

图7 aralar和SCaMC-3的活化对于MCU KO小鼠的线粒体氧化不是必需的

总结

本文研究了线粒体钙Ca²⁺和胞质钙Ca²⁺在肝脏线粒体脂肪氧化调节中的作用，通过构建肝脏特异性线粒体钙单向转运蛋白敲除(MCU KO)小鼠模型，发现MCU KO小鼠线粒体钙Ca²⁺下降，而细胞质钙Ca²⁺上升。尽管MCU KO小鼠的线粒体Ca²⁺降低，但是其体内异柠檬酸脱氢酶通量、α-酮戊二酸脱氢酶通量和琥珀酸脱氢酶通量却显著上升。其次，MCU KO肝切片显示[¹⁴C₁₆]棕榈酸氧化率和肝内脂肪分解率升高，进而导致肝内甘油三酯含量降低，同时发现这些现象与CAMKII激活相关。通过Q-FLUX等技术手段，研究人员发现CAMKII的激活可以促进线粒体糖异生、丙酮酸和谷氨酰胺回补，并增强线粒体氧化。这表明胞质Ca²⁺激活CAMKII可能是MCU KO促进肝脏线粒体氧化增加的主要机制。总之，该文章表明肝脏线粒体氧化可以与线粒体Ca²⁺分离，并揭示了胞质钙Ca²⁺在肝脏脂肪线粒体氧化、肝内脂肪分解和糖异生的调节中的关键作用。

原文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1550413124002870?via%3Dihub

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代谢学人

华东师范大学生命科学学院肥胖和代谢性疾病研究组，主要介绍肥胖相关知识和科研进展。