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撰文 | 夏志蕊 王颖雯 朱丽君 刘爽 曹玉香
编辑 | 孟美瑶
校对 | 朱丽君
背景介绍
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电子传递链（ETC）
线粒体ETC是发生在哺乳动物线粒体内膜中的关键细胞过程。它通过氧化磷酸化在产生能量的过程中起着举足轻重的作用。ETC由复合体I-V组成，有助于质子从线粒体基质泵入膜间隙（IMS）（小编注：线粒体膜间隙是线粒体外膜与线粒体内膜之间的空隙，宽约6-8nm，其中充满无定形液体。由于线粒体外膜含有孔蛋白，通透性较高，而线粒体内膜通透性较低，所以线粒体膜间隙内容物的组成与细胞质基质十分接近，含有众多生化反应底物、可溶性的酶和辅助因子等）以合成ATP。哺乳动物通过糖酵解、柠檬酸循环、氨基酸和脂肪酸氧化分解营养物质会产生大量NADH和FADH2。NADH和FADH2分别在复合体I和复合体II被氧化成NAD和FAD并将电子转移到泛醌（CoQ）并将其还原为泛醇（CoQH2）。CoQH2在膜内自由扩散并将电子传递到复合体III，复合体III通过细胞色素c（Cyt c）将它们传递到复合体IV。通过电子转移，复合体I、III和IV消耗能量将质子从线粒体基质泵到IMS，从而产生电化学梯度。此电子梯度被FoF1-ATP合酶利用通过氧化磷酸化来合成ATP（ATP合酶又称复合体V）。其中复合体I和III是ETC中ROS产生的两个主要位点，复合体I的ROS产生通常由琥珀酸驱动的反向电子转移触发，导致CoQ池高度减少，而复合体III产生的ROS可以进入线粒体基质和膜间空间。
参考文献：
[1] Zotta A, et al. Trends Immunol. 2024 Apr;45（4）:259-273.
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ETC和肝脏疾病
NAFLD是一种复杂的多因素疾病，与多种遗传、表观遗传和环境因素有关。描述NAFLD的发病机理的“二步法”假说中表明NAFLD（第一步）首先是由胰岛素抵抗（IR）引起的，它会导致肝脏脂肪变性，肝脏脂肪生成增加，但游离脂肪酸（FFA）降解受损。脂肪堆积使肝脏敏感，接着（第二步）通过氧化应激进一步诱导炎症和细胞死亡，最终导致NASH和纤维化。氧化应激已被认为是NAFLD肝损伤和疾病进展的主要原因，氧化应激反映了活性氧（ROS）的产生与抗氧化系统清除能力之间的不平衡，ROS包括超氧阴离子自由基（O2-）和过氧化氢（H2O2）作为不同类型肝细胞中能量代谢的副产物在细胞内持续产生。肝脂质超载通过影响几种ROS生成机制来诱导氧化剂的过量产生，在高浓度下，ROS会引起细胞大分子（DNA、脂质、蛋白质等）的氧化修饰，并导致受损大分子的积累，诱发肝损伤。电子传递链（ETC）是主要的线粒体ROS产生位点，其中氧的单电子还原可能发生在复合体I、II和III处，导致O2-的产生以及由此衍生的其他产物的产生。在ETC中，复合体I（包括正向和反向电子转移（FET和RET））、复合体II和复合体III中的泛醌循环是ROS的重要来源，复合体I和III中的FMN、Fe-S团簇和Q结合位点等特定位点的电子载体保持高度还原状态使线粒体O2-产生成为可能，并且这使得电子从ETC中“泄漏”出来。在NAFLD进展过程中，线粒体脂肪酸氧化（FAO）增强而没有伴随ETC上调，更多的底物衍生的还原当量进入受损的ETC并从复合体I和III泄漏将导致ROS过量产生。在FFA特别是PUFAs的存在下，O2-产生大大增加，FFA可以与ETC的组分相互作用，从而减慢FET的速率并增强O2-的产生。
参考文献：
[1] Chen Z, et al. Free Radic Biol Med. 2020 May 20;152:116-141.
[2] Shinmura K. Oxid Med Cell Longev. 2013;2013:528935.
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酰基辅酶A合成酶短链家族成员2（ACSS2）
在细胞质中，乙酰辅酶A由丙酮酸氧化脱羧或脂肪酸的β-氧化产生，产生的乙酰辅酶A可以与草酰乙酸反应生成柠檬酸，被用来合成酮体、脂肪酸和胆固醇等脂类；而细胞在某些代谢压力下（如低氧、脂质耗尽），可以利用醋酸与辅酶A发生反应，在ACSS2的催化下生成乙酰辅酶A。
乙酰辅酶A在乙酰辅酶A羧化酶（ACC）的催化下生成丙二酰辅酶A。ACC是脂肪酸合成的限速酶，这是脂肪酸合成的第一步，也是调节脂肪酸合成的主要位点。
之后丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A在脂肪酸合酶FAS（由 FASN 基因编码）催化下，生成棕榈酸。棕榈酸是一种直链16碳脂肪酸，是膜磷脂（PL）和脂肪三酰基甘油（TAG）的成分。棕榈酸水平升高促进动脉粥样硬化、2型糖尿病、神经退行性疾病、肥胖和癌症的病理生理发展。
在营养匮乏的条件下，葡萄糖缺乏导致ACSS2
Ser659位点的AMPK依赖性磷酸化，随后ACSS2的核定位信号暴露并与importinα5结合，促进了ACSS2的核易位。在细胞核中，ACSS2与转录因子EB结合并转运至溶酶体和自噬基因启动子区域，并利用组蛋白脱乙酰化产生的乙酸盐在转录因子EB的启动子区域局部重新产生乙酰辅酶A用于组蛋白乙酰化，从而促进溶酶体和自噬相关基因表达并抵消营养应激的作用。在营养缺乏条件下，ACSS2同样通过在细胞核中促进组蛋白乙酰化来促进脂肪酸氧化相关基因的表达，促进脂肪酸氧化为机体提供能量。
参考文献：
[1] Mak HY, et al. Nat Commun. 2021 Nov 25;12(1):6877.
[2] Li X, et al. Autophagy. 2017;13(10):1790-1791.
2.肝脏再生过程中需要功能性线粒体ETC；
3.线粒体复合体IV抑制后刺激胆道上皮细胞的转分化，以促进肝再生；
4.抑制PDK4使ETC功能失调的肝细胞重新获得增值的能力。
研究结果
1
为了研究肝脏再生环境下线粒体在体内的变化，研究人员使用MITO-TAG基因小鼠（小编注：MITO-Tag小鼠能够从体内特定细胞类型中快速分离线粒体），该小鼠可以诱导HA标记的线粒体外膜蛋白（HA-tagged mitochondrial outer membrane protein，HA-GFP-omp25）的表达。抗HA磁珠的快速pull down实验可以在高富集的馏分中分离完整的细胞器，从而可以在特定细胞群体中对线粒体代谢物进行细胞器定量。研究人员将该基因与许多Cre诱导基因（小编注：雌激素诱导型Cre-ER通过将雌激素受体（ER）的配体结合区与Cre重组酶相融合，形成定位于胞浆中的融合蛋白（Cre-ER），Cre-ERT2是雌激素诱导型Cre-ER的一个突变体，避免内源雌激素的干扰只响应外源人工合成雌激素，实现对靶基因的时空特异性敲除；Alb-cre诱导的基因重组能够使肝小叶中全部肝细胞被标记；Gls2-CreERT2诱导的基因重组能够使肝小叶中1区（谷氨酰胺合酶2）Gls2表达阳性的肝细胞被标记；Igfbp2-CreERT2诱导的基因重组能够使肝小叶中2区胰岛素样生长因子结合蛋白2（Igfbp2）表达阳性的肝细胞被标记；Glul-CreERT2诱导的基因重组能够使肝小叶中3区谷氨酸氨连接酶（Glul）表达阳性的肝细胞被标记。Gls2表达阳性的肝细胞主要分布在肝小叶中1区，Igfbp2表达阳性的肝细胞主要分布在肝小叶中2区，Glul表达阳性的肝细胞主要分布在肝小叶中3区，所以把这几个基因作为1、2、3分区的marker，选定了以上几个CRE模型）偶联，这些基因在各种肝细胞群体中诱导重组（图1A、B）。经纯化后细胞器的蛋白印迹分析表明，在没有其他细胞器污染的情况下，线粒体蛋白具有高富集和特异性（辅图1A）。随后，小鼠接受70%肝切除术（PHx），并在第0天（PHx前）或第2天（PHx后）收集血浆样本和肝脏线粒体，然后进行LC-MS代谢组学分析（图1C）。研究人员观察到PHx后几种血浆代谢物的变化，这些变化在不同的Cre系之间基本上是保守的（辅图1B、C）。这些变化包括磷酸乙醇胺和氨基酸种类的增加，以及游离脂肪酸和酰基肉碱种类的减少（辅图1C）（小编注：之前有报道肠道微生物群通过促进肝膜磷脂的生物合成激活肝再生。[1] Yin Y, et al. J Hepatol. 2023 Apr;78(4):820-835.）。
为了评估肝脏再生过程中肝脏线粒体的变化，研究人员首先使用血清白蛋白（Alb）启动子驱动Cre重组酶的介导下评估了所有肝细胞的线粒体（图1D-F），通过与对照组的pull down比较，在第0天和第2天的样本中定量测定了173种常见的线粒体特异性代谢物（图1D）。其次，通过主成分分析（PCA）（小编注：是一种数学降维方法，利用正交变换把一系列可能线性相关的变量转换为一组线性不相关的新变量，也称主成分，从而利用新变量在更小的维度下展示数据的特征）分析了第0天和第2天的线粒体的代谢组，经差异分析显示许多代谢物发生变化（图1E）。对再生过程中调控水平最高的线粒体代谢物的评估表明，酮体、脂质和氨基酸代谢发生了变化（辅图2A）。研究人员还观察到脂肪酸氧化产物和酮体（乙酰乙酸（q = 0.0029），β -羟基丁酸（q = 0.0074）和乙酰辅酶A（q = 0.0038））在PHx第2天后显著升高（图1F）。其他种类的辅酶A（如琥珀酰辅酶A，丙酰辅酶A）和生酮氨基酸没有升高，也没有观察到丙酮酸或大多数线粒体TCA循环代谢物的变化（辅图2B）。
有研究表明，肝细胞对PHx后再生的贡献是多种多样的，其中起主要作用的是门静脉周围（1区）和中区（2区）的肝细胞。因此，研究人员利用了具有区域特异性Cre的小鼠（图1A、B），结合上述的MITO-TAG来评估第0天和PHx后第2天肝脏线粒体代谢组的变化。在第0天时，线粒体代谢组在各区域之间基本相似（辅图2C）。然而，在PHx第2天后，通过无监督分析识别（小编注: 无监督分析学习是一类机器学习任务，其中算法在没有标签的情况下，从未标记的数据中学习模式和结构；它主要应用于数据聚类（是无监督学习的一种主要任务，旨在将相似的数据点分组）、降维（降维技术用于减少数据的维度，以便更好地可视化和分析数据）和异常检测（无监督学习还用于检测数据中的异常点或异常模式）发现线粒体代谢物具有明显的区域特征（辅图2C）。特别是1区和2区线粒体代谢组发生了很大的变化，而3区线粒体代谢组的变化相对较小（图1G，辅图2D）。结果显示，1区和2区线粒体表现出乙酰乙酸、β-羟基丁酸和乙酰辅酶A以及脂肪酸氧化中间体的升高（图1H），而生酮氨基酸或TCA循环代谢物没有升高（辅图2E、F），3区线粒体在脂肪酸代谢物亚群中也表现出类似的升高（图1H），并且许多线粒体TCA循环代谢物出现了升高（辅图2G）。
这些数据表明再生肝细胞的线粒体代谢组与稳态肝细胞相比存在差异，这些差异主要表现为脂肪酸氧化（FAO）产物。为了确定PHx后肝脏是否发生脂肪酸氧化，研究人员通过尾静脉给小鼠注射了用13C（[U-13C]）标记的棕榈酸和牛血清白蛋白（BSA）（小编注：小鼠尾静脉注射的是棕榈酸和BSA偶联物，棕榈酸（PA）这一游离脂肪酸在生理pH下溶解度较低难溶于水，但游离脂肪酸能够与BSA稳定结合并且有效地将游离脂肪酸输送到体内，模拟体内脂质运输时，脂质包裹在载脂蛋白中，同时也减轻了细胞毒性。BSA能够结合和运输脂肪酸、激素、维生素等小分子，从而促进这些物质在培养基中的均匀分布，并使细胞能够更有效地摄取和利用这些营养成分）（辅图3A），结果显示血浆中游离棕榈酸（FA 16:0）的标记率约为25%（辅图3B）。在FAO期间，酰基辅酶A去除两个碳单元成为乙酰辅酶A，然后进入TCA循环进一步氧化或转化为酮体（辅图3A）。在经注射的小鼠中，研究人员观察到血浆以及心脏和肝脏组织中14:0、12:0、10:0、8:0、6:0和4:0酰基肉碱的标记减少（小编注：由脂肪酸（即酰基）与左旋肉碱结合而产生的酰基肉碱可使脂肪酸进入线粒体，在许多细胞能量代谢途径中起着重要作用，酰基肉碱被用作先天性脂肪酸氧化错误的重要诊断标志物，并作为能量代谢、线粒体和过氧化物酶体β氧化活性缺陷、胰岛素抵抗和身体活动的标志物；短链酰基肉碱（C2-C5）在能量生产中发挥重要作用；中链酰基肉碱（C6-C12）是遗传性脂肪酸代谢疾病的标志物；长链酰基肉碱（C13-C20）与各种心血管疾病有关），与FAO活性一致（辅图3C）。由于酰基肉碱和酰基辅酶A经常相互转换，因此它被用作标记酰基辅酶A。研究人员还观察到乙酰-肉碱（2:0肉碱）和乙酰辅酶A中的m+2标记（小编注：指13C同位素标记该分子中C原子的数量，“+2”代表着该分子中有两个C原子被同位标记，能够用于示踪代谢底物的去向和相应的富集程度），与完全标记的棕榈酸的FAO活性一致（辅图3C、D）。乙酰辅酶A可以转化为β-羟基丁酸或进入TCA循环，经过一次TCA循环后产生m+2标记和m+1标记。研究人员观察到m+2 β-羟基丁酸以及m+2和m+1 TCA循环中间体中被大量标记（辅图3D、辅图4）。正如预期的那样，研究人员没有在丙酮酸和乳酸（糖酵解中间体）中观察到m+2或m+3标记（小编注：棕榈酸发生β-氧化的主要产物乙酰辅酶A直接参与TCA循环，但并不参与糖酵解的过程，所以棕榈酸不会代谢成丙酮酸和乳酸）（辅图3D、辅图4）。这些标记模式在PHx前后都与FAO活性一致。在肝组织中，研究人员观察到PHx后m+2乙酰辅酶A（P = 0.0044）、m+2 β-羟基丁酸（P = 0.00092）和一些m+2 TCA循环中间体（柠檬酸，P=0.00018；琥珀酸，P=0.00030；延胡索酸，P=0.038）（辅图3D）。这些数据表明，PHx后肝脏的FAO能力可能会增强。
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肝脏生长分区与肝再生
肝脏的基本结构单位是肝小叶，肝小叶中的肝细胞由于代谢功能和基因表达等的不同具有较大的异质性，从肝门静脉区到肝中央静脉区大体可分为三区：门静脉周围肝细胞（E-CAD+，Zone 1）、中间区肝细胞（E-CAD–GS–，Zone 2）和中央静脉周围肝细胞（GS+，Zone 3）。为了提供体内细胞增殖的高空间分辨率检查，中科院上海生物化学与细胞生物学研究所的周斌团队开发了一种遗传增殖谱系追踪方法---ProTracer。ProTracer利用广泛使用的细胞增殖标记物Ki67, 在基于课题组前期开发的Dre-rox和Cre-loxP的双同源重组酶介导的遗传谱系示踪技术基础上，利用Dre-rox启动Cre同源重酶介导的细胞增殖示踪系统进行遗传标记，能够以高空间分辨率连续记录特定细胞谱系中的细胞增殖事件。通过ProTracer，他们发现在肝切模型中，位于Zone 1的肝细胞起始肝脏再生过程，然后Zone 2 的肝细胞迅速增殖。而在胆管结扎和CCl4急性损伤模型中，则是位于Zone 2的肝细胞起始肝脏再生过程。
肝小叶是肝细胞再生和再生肝脏重复结构，其具有六边形结构，每个角都有中央静脉和门静脉三联征（门静脉、肝动脉和胆管），由肝细胞隔开。肝小叶中肝细胞从门静脉到中央静脉表现出不同特殊功能，由此形成三个区域；2区肝细胞是稳态增殖的主要贡献者，而1区和3区的肝细胞分别在3区和1区受损后能够再生肝脏。
参考文献：
[1]He L, et al. Science. 2021 Feb 26;371(6532):eabc4346.
[2]Andersson ER, et al. Science. 2021;371(6532):887-888.
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脂肪酸氧化中的脂酰-CoA转运
在脂肪酸的氧化过程中，脂肪酸首先在在脂酰CoA合成酶的催化作用下合成脂酰-CoA。由于长链脂酰-CoA不能直接透过线粒体内膜，需利用脂酰-CoA转运体系将其转变为基质内的脂酰-CoA。在脂酰-CoA转运体系中，肉碱脂酰转移酶1 （CPT-1）位于线粒体外膜，在细胞质基质的脂酰-CoA进入膜间隙后，在CPT-1的催化下，脂酰基被转移到肉碱的β-羟基，形成脂酰肉碱，CoA则被游离出来并返回到细胞质基质。脂酰肉碱在线粒体内膜上特定的转位酶的帮助下进入基质。在位于内膜基质一侧CPT-2的催化下，脂酰基被转移到基质CoA的巯基上重新生成脂酰-CoA，肉碱又经转位酶反向运输出基质。当细胞质基质中的脂酰-CoA转化为线粒体基质中的脂酰-CoA，脂肪酸的β-氧化正式开始。
参考文献 ：
[1]王镜岩.生物化学.上册[M].高等教育出版社,2002.
图1 小鼠肝脏区域特异性线粒体代谢组学
辅图1 区域特异性线粒体pull down结果
辅图2 肝脏再生过程中的肝脏线粒体代谢组
辅图3 用U-13C棕榈酸示踪法测定体内脂肪酸氧化能力
辅图4 体内[U-13C]棕榈酸追踪同位素分布
2
为了直接研究肝脏再生过程中对线粒体ETC活性的需求，研究人员使用了携带复合体I （Ndufa9）、II （Sdha）、III （Uqcrq）、IV （Cox10）或V （Atp5f1a）关键成分的单个条件敲除等位基因的小鼠。并且证实了与先前使用这些等位基因的研究一致，在给予AAV-Cre后，每个复合体敲除小鼠的肝组织中相应蛋白质的表达、复合体的活性和组装均显著降低（辅图5A-G）。研究人员首先用低剂量的AAV-Cre感染小鼠，诱导约5%的肝细胞重组（图2A、B）。在这些实验中，使用条件报告等位基因（mitoDendra2flox）（小编注：荧光蛋白Dendra2是一种单体GFP样蛋白，属于Kaede样光转换荧光蛋白族，当暴露于紫蓝光时，具有从绿色到红色发光状态的不可逆光转换；由于单体状态和适当的pKa值，Dendra2可以用作生理pH范围内的pH传感器，在酸性环境中，由于发色团酚基的质子化，Dendra2变成绿色；线粒体特异性Dendra2蛋白能够特异性感受线粒体内pH变化，显示出不同程度的绿色荧光）来标记感染细胞，并在再生过程中进行示踪。研究人员观察到WT和Ndufa9−/−小鼠的肝细胞在PHx后2周显著增加，组间无显著差异，相反并没有观察到Sdha−/−、Uqcrq−/−、Cox10−/−或Atp5f1a−/−小鼠肝细胞的增加（图2B、C）。定量分析DENDRA2+HNF4α+肝细胞（小编注：肝细胞核因子4α （HNF4α） 是核受体超家族中高度保守的成员，在肝脏、肾脏、胰腺和肠道中高水平表达。在肝脏中，HNF4α仅在肝实质细胞中表达，是肝分化的主要调节因子，调节大量涉及肝细胞特异性功能的基因，对于胚胎和出生后的肝脏发育以及成人的正常肝功能是不可或缺的）在PHx-2周后的总百分比显示，与WT或Ndufa9−/−肝细胞相比，Sdha−/−、Uqcrq−/−、Cox10−/−或Atp5f1a−/−肝细胞的表达存在显著（P<10−15）抑制（图2C），表明复合体II、III、IV或V（而非复合体I）的抑制会以细胞自主的方式损害肝再生过程中的肝细胞增殖。（小编注：作者为确认肝脏线粒体ETC对于肝细胞增殖的作用，通过低剂量和高剂量注射AAV-Cre病毒的方式，在不同情况下验证线粒体ETC的功能，低剂量模型中的小鼠通常能长期存活从而能够实现较长时间内再生肝细胞的情况示踪，而高剂量模型中的小鼠由于ETC功能的完全丧失难以长期存活而无法达到示踪的目的）
为了确认肝脏线粒体ETC功能完全丧失的影响，研究人员使用静脉注射高剂量表达GFP或Cre重组酶（由肝脏特异性SERPINA7启动子驱动）的AAV8病毒（图2D），使感染Cre的肝脏中靶蛋白的表达完全丧失（辅图5B）。病毒注射4周后，研究人员对对照组（AAV8-GFP感染，以下称为flf）和敲除组（AAV8-Cre感染，以下称为−/−）动物进行70% PHx。在PHx一天后，研究人员在WT和Ndufa9−/−小鼠肝脏中观察到CCND1 （Cyclin D1）的表达，这是肝细胞增殖的早期标志物（辅图5H、I）。由于没有在Sdha−/−，Uqcrq−/−，Cox10−/−或Atp5f1a−/−肝脏中观察到CCND1的表达（辅图5I），表明复合体II到V是PHx后肝细胞增殖所必需的。
WT、Ndufa9−/−和Cox10−/−小鼠通常在PHx后存活，而Sdha−/−，Uqcrq−/−，和Atp5f1a−/−动物在PHx后24至48小时内死亡。研究人员评估了存活基因型（Ndufa9−/−和Cox10−/−）小鼠的肝脏，以研究器官再生过程中ETC功能障碍的长期后果（图2D）。在PHx后2天，研究人员在对照和Ndufa9−/−小鼠肝脏中观察到大量BrdU+细胞（小编注：指在细胞增殖时期，5-溴脱氧嘧啶核苷（BrdU）代替胸腺嘧啶渗入到正在复制的DNA分子中，从而使细胞DNA被标记；对BrdU+细胞用特异性抗BrdU单克隆抗体检测BrdU，能够准确、全面的定量DNA合成程度），表明复合体I对于肝细胞增殖不是必需的（辅图6A、B）。相比之下，在对照组肝脏的磷酸-HISTONE3染色（小编注：Ser10 上的组蛋白 H3 磷酸化对有丝分裂具有特异性，磷酸化组蛋白 H3 （PHH3） 增殖标记物更为普遍地用于评估各种肿瘤的增殖。PHH3 染色更能突出有丝分裂细胞，更容易观察到染色的细胞核是否表现出有丝分裂的形态特征；相比于通过传统的HE染色进行计数有丝分裂图（MF）统计，PHH3 染色在细胞有丝分裂的分类统计过程中减少主观性提高灵敏度和精确度）的阳性细胞显著高于Cox10−/−肝脏（辅图6C），表示在损伤2天后Cox10−/−组小鼠肝脏表现出严重的细胞增殖抑制，但在后来的时间点没有显著变化（图2E、F）。组织学分析显示，与对照组和Ndufa9−/−肝脏相比，Cox10−/−肝脏中存在大量肝细胞脂质积累和器官重量增加（图2E、G，辅图6D、E），无坏死或凋亡迹象（辅图6F）。研究人员在CCl4诱导急性肝损伤小鼠模型中观察到了类似的结果（辅图6G），CCl4在给药2天后，对照组肝脏切片中BrdU+细胞显著增加，而Cox10−/−肝脏中却没有该现象（辅图6H-J）。
AOX（小编注：植物、酵母和不包括昆虫和脊椎动物在内的许多低等生物中含有交替氧化酶（AOX），是植物线粒体呼吸链中交替氧化途径末端的氧化酶，它主要负责植物线粒体电子传递链中把电子从UQ库传递给O2生成H2O，同时也是细胞氧化还原平衡的重要传感器，有助于维持线粒体中代谢过程的动态平衡，并且可以抵抗呼吸应激条件；在天然缺乏AOX的细胞中，会在异位表达后自动输入线粒体区室重新折叠并在ETC的细胞色素复合体被阻断时参与催化）是一种可以氧化泛醌并减少线粒体中的氧的酶（辅图7A），其异位表达通过恢复泛醌氧化和氧气消耗，赋予癌细胞对复合体IV抑制剂和复合体III缺乏的抗性。因此，研究人员测试了AOX在Cox10−/−肝细胞中的表达是否足以缓解肝再生过程中的增殖缺陷。感染AAV-Cre-IRES-AOX的Cox10flf动物在PHx后表现出BrdU+细胞恢复，肝脏重量和脂肪积累减少，表明AOX的异位表达足以逆转该遗传模型中的再生缺陷（辅图7B、C）。这些结果表明，在PHx后，肝细胞增殖需要细胞自主方式的功能性线粒体ETC，而线粒体复合体I对于肝脏再生并不是必需的。
图2 线粒体ETC是肝脏再生必需的
辅图5 再生过程中线粒体ETC敲除肝脏结果分析
辅图6 肝脏再生不需要线粒体复合体I
辅图7 线粒体复合体IV的缺乏可以通过AOX的过表达来挽救
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线粒体复合体IV功能缺失的情况下，胆管细胞代偿并促进肝脏再生
肝细胞特异性Cox10缺失（通过AAV8-SERPINA7-Cre感染）的小鼠与WT小鼠在部分肝切除手术中存活率没有显著差异（图3A）。肝切除手术后2周、4周和8个月的肝脏组织学分析显示，在早期时间点（PHx 2至7天后，图2E）观察到了充满脂滴的肝细胞，在随后的时间点脂滴大量减少（图3B），这表明存在一种替代细胞可能有助于肝脏再生。先前的报道表明，在没有肝细胞增殖的情况下，胆管细胞（胆道上皮细胞（BECs））可以转分化为肝细胞并促进肝脏再生（小编注：2023年发表在nature genetics上的文章（doi:10.1038/s41588-023-01335-9）具体研究并揭示了BECs转分化为肝脏细胞的细胞及分子调控机制，和双向潜能肝脏祖细胞促进肝脏再生的机制）。事实上，在早期时间点对Cox10−/−肝脏的分析显示，BrdU染色定位于胆道结构附近，并与胆管细胞的CK19+染色共定位（图3C，辅图8A），DENDRA2−细胞是指非Cre表达的细胞，通过对后期Cox10−/−肝脏的免疫荧光结果可以得知，CK19+基本定位在DENDRA2-区域，说明胆管细胞可能转分化为肝细胞。（辅图8B、C）。
因此，研究人员使用Ck19-Cre结合tdTomato报告等位基因（小编注：正常情况下在tdTomatoflf小鼠中，tdTomato基因表达元件上游存在的表达终止元件会阻断tdTomato的表达。当这一基因型小鼠与表达Cre重组酶的小鼠交配后，可在其子代的Cre阳性细胞及这些细胞的下游分化衍生谱系中发生由Cre重组酶介导的loxP位点间表达终止元件的删除，实现tdTomato蛋白的条件性表达，继而可通过荧光显微镜在相关组织或细胞中观测到强烈的tdTomato红色荧光信号）来追踪PHx后WT和Cox10−/−肝脏中胆管细胞的命运。在这些实验中，研究人员使用表达Cas9的小鼠，在肝细胞中感染表达对照或Cox10靶向sgRNAs的AAV8病毒（图3D、E）。在Cox10靶向的肝脏中，研究人员观察到tdTomato+ HNF4α+细胞的大量增殖，而在对照肝脏中没有观察到这一点（图3F）。因此，在缺乏肝细胞复合体IV功能的情况下，胆管细胞进行转分化并促进肝脏再生。研究人员还观察到，在Cox10−/−且无PHx条件下，8个月时非肝细胞群体（也就是胆管来源的细胞）在Cox10−/−小鼠中占比增加（辅图8D），这表明BECs的转分化可能在肝细胞线粒体功能障碍中发挥生理作用。（小编注：肝细胞可以转化为成熟的胆管细胞，形成功能稳定、稳定的胆道系统，但是胆管细胞只有在肝细胞增殖完全被抑制时，或者在小鼠长期严重损伤的情况下，胆管细胞才能转分化为肝细胞）
研究人员假设Cox10−/−动物在PHx后的存活（图3A）依赖于BEC扩增。为了研究这一点，研究人员使用了Albumin-Cre等位基因，结合条件Cox10flox和mitoDendra2flox等位基因，导致肝细胞和BECs中Cox10缺失和报告基因表达（辅图8E）。与之前一样，研究人员观察到在PHx第2天后BrdU掺入量大幅下降（图3G，辅图8F）。与通过AAV8-SERPINA7-Cre感染肝细胞特异性缺失Cox10的小鼠相比（图2D-G），这些小鼠（由肝细胞和BECs中Alb-Cre表达驱动的Cox10缺失）表现出快速的生存缺陷（图3H）。这些结果表明，在肝细胞复合体IV抑制的情况下，BECs的转分化是肝脏再生所必需的，并且对存活至关重要。
最近的一项研究表明，BECs向肝细胞的转分化是通过过渡性肝祖细胞（TLPC）（小编注：肝脏严重损伤且当肝脏细胞介导的再生功能无法发挥时，胆管上皮细胞（BECs）具有转分化为功能性肝脏细胞的潜力；TLPC起源于BECs，并在肝脏严重损伤后的再生过程中分化为肝脏细胞，TLPC本身具有分化为BECs和肝脏细胞的双向分化潜能，当BECs激活Notch信号通路，将完全抑制BECs向TLPC的转分化，阻碍肝脏再生；在BECs中激活Wnt/β-catenin信号通路，则将促进BECs向TLPC转分化，进而促进TLPC向肝脏细胞分化）第1期（CK19+，HNF4α+）和TLPC第2期（CK19-，HNF4α+）的顺序过程发生的，随后才成为真正的肝细胞。对肝脏早期再生阶段的单细胞分析已经捕获了1期TLPCs，其表现出Notch信号的改变以完成转分化过程。相比之下，人们对2期TLPCs的性质知之甚少。研究人员认为，在再生后期检测Cox10−/−肝脏的单细胞特性可能对于分离独特的细胞群和研究与转分化相关的过程具有提示作用。为此，研究人员在PHx4周后对WT和Cox10−/−肝脏进行了单核RNA测序（snRNAseq）（图3I）。WT肝脏主要由肝细胞组成，小部分包括免疫细胞、星状细胞、库否细胞和内皮细胞（图3I，辅图9）。相比之下，Cox10−/−肝脏显示出两种不同的肝细胞群（称为KO1和KO2），以及胆管细胞和其他细胞群的富集（图3I）。尽管WT肝细胞群体表现出三个肝区基因特征（图3J），但来自Cox10−/−肝脏的肝细胞表现出更加明显的区域特征。具体来说，KO1肝细胞群体表现出三个区域标记的表达，而KO2肝细胞则在2区标记中富集（图3K、L）。
为了更详细地研究转分化过程，研究人员重点分析了Cox10−/−肝脏中的肝细胞和胆管细胞群体，它们在均一流形近似和投影（UMAP）分析（小编注：在高维单细胞数据的可视化展示中，需要通过降维和可视化去展示细胞数据特征，单细胞降维技术能够能够避免集群表示过度拥挤，在重叠区域上能表示出不同的集群而被广泛运用，而UMAP是一种非常有效的可视化和可伸缩降维算法，与传统的降维技术t-SNE相比，UMAP算法在可视化质量方面具有竞争优势，并且它保留了更多全局结构、具有优越的运行性能、更好的可扩展性）中距离较近（图3M）。聚类分析显示两群胆管细胞，具有1期TLPCS（深蓝色，Spp1+， Hnf1β+， Hnf4α+）和2期TLPCs（青色，Spp1−，Hnf1β−，Hnf4α+）的特性（图3N）。研究人员使用Spp1和Hnf1β作为胆管细胞身份的指标，对这两种转分化胆管细胞群体的实验富集和鉴定为比较转分化过程中的表达谱提供了证据。2期TLPC表达2区（Igfbp2）和3区（Glul）肝细胞识别标志物，而这在1期TLPC中是不存在的（图3N）。研究人员还对1期和2期TLPC进行了GO分析。在2期TLPC中，前5条上调通路与脂肪酸/脂质代谢有关，这表明2期TLPC在接受肝细胞命运的过程中大量富集了脂肪酸氧化相关蛋白（图3O，辅图10A）。此外，研究人员注意到与1期TLPC相比，2期TLPC中代谢基因Pdk4和Pparα的表达升高（辅图10B、C），这与BEC转分化过程中脂肪酸氧化升高一致。
图3 肝细胞线粒体复合体IV抑制后可刺激胆道上皮细胞转分化
辅图8 胆道上皮细胞促进Cox10−/−肝脏再生
辅图9 Cox10fl/fl和Cox10−/−肝脏的单细胞分析
辅图10 2期TLPC中脂肪酸代谢通路表达增加
4
肝脏再生过程中外周脂肪的氧化受到刺激
以上结果表明，ETC功能是肝脏再生过程中所需要的。此外，再生过程中线粒体特异性代谢变化主要集中在脂肪酸代谢上。先前已经观察到肝再生过程中WT肝脏的短暂脂肪变性，由于PHx的动物存在外周脂肪储存消耗现象，因此研究人员推测外周脂肪转运到了肝脏，并在WT小鼠中验证了这一点。结果显示，在PHx2天后观察到了肝脏中的脂质积累，并在PHx后4天消失（图4A），且伴随着性腺脂肪的特异性消耗（辅图11A-C）。相比之下，Cox10−/−肝脏表现出大量脂肪积累，并且没有迅速清除（图4A）。肝组织中游离脂肪酸的代谢组学测量证实，几种脂肪酸在对照肝脏中短暂积累，但在Cox10−/−肝脏中持续积累（图4B，辅图11D）。
由于肝再生过程中肝脂质的来源和命运尚未验证，研究人员在活体小鼠中注射了D2O（2H2O），它可以在脂肪酸合成过程中通过NADPH的转移有效地标记脂肪酸中的氢（图4C）。首先通过单次注射D2O测量了进行和未进行PHx的动物的脂质合成，然后在5小时后评估其与肝脏脂质的结合情况（图4D）。结果显示，在基础水平下观察到WT肝脏中肝脂质的标记在1-10%之间，在PHx 2天后标记被抑制（图4E）。在Cox10−/−肝脏中，脂质标记相较于WT小鼠被进一步抑制（图4E）。由于总脂肪酸池的实质性变化，研究人员还查了标记物的同位素丰度。对于大多数脂肪酸，在PHx后，标记的峰值丰度在Cox10−/−肝脏中被抑制（辅图11E）。总之，这些数据表明，脂肪酸合成对PHx后WT或Cox 10−/−肝脂肪变性的增加没有显著贡献。
然后，研究人员进行了长期的D2O脉冲/追逐实验（小编注：脂肪组织甘油三酯的预标记：小鼠用D2O (重水)标记7周，使体内组织充满氘。经过处理后，氘迅速融入整个生物体体内，使水体中的氘富集量高达5%。通过摄入8%的D2O作为饮用水来维持氘的富集，从而使其成为长期体内实验研究的最佳标记方法。然后给予小鼠无标记饮用水，以将氘标记从生成较快的组织(即肝脏)中洗掉，但没有足够的时间来显着减少脂质转化较慢的组织(如脂肪)中的标记），以标记外周脂肪中的脂质。在PHx之前，给动物自由饮用D2O标记的水7周，然后进行2周的洗脱期（小编注：在洗脱期给予小鼠自由饮用非氘标记的饮用水两周，以去除小鼠体内氘标记）（图4F）。在标记期间，标记脂肪酸在脂肪和肝组织中积累，然而，在洗脱过程中，肝脏中的脂肪酸被迅速逆转，而脂肪组织中的脂肪酸相对稳定。在9周的脉冲/追踪期结束时，研究人员观察到脂肪组织中有10%至50%的脂肪酸被标记，而肝脏中的水平较低（1至10%）（图4G，第0天）。在接受PHx的小鼠中，研究人员观察到在PHx第1天后肝脏中脂肪酸种类标记的增加（图4G，辅图12）。在WT肝脏中，标记在第2天减少，表明脂肪酸种类的快速逆转。相比之下，标记的脂肪酸种类在PHx后第2天继续在Cox10−/−肝脏中积累（图4G，辅图12）。肝脏脂肪酸种类的同位素分布与脂肪垫中的同位素分布相似（辅图13A、B），与外周脂肪是肝脏脂质的主要来源一致。因此，外周脂肪在PHx后转运到肝脏，它们的周转受到线粒体复合体IV功能性的调节。
在再生过程中，标记脂肪酸在Cox10−/−肝脏中的持续积累表明，这些小鼠的脂肪酸清除受损。线粒体脂肪酸氧化是脂肪酸清除的潜在机制，这将导致乙酰辅酶A和酮体物质的产生，如β-羟基丁酸和乙酰乙酸（图4H），研究人员之前观察到，在PHx2天后， 1区和2区中这些物质升高（图1）。因此，研究人员从接受上述长期D2O标记实验的对照小鼠肝脏中测量了乙酰辅酶A和β-羟基丁酸的氘标记（图4F）。结果显示，在PHx 1天和2天后，标记量大幅增加（图4I，辅图14A、B）。乙酰辅酶A和β-羟基丁酸的标记在Cox10−/−肝脏中受到很大程度的抑制，这与这些组织中缺乏功能性β氧化一致（图4I，辅图14A、B）。研究人员通过检查原代肝细胞体外氧化14C标记棕榈酸的能力来验证这一发现（辅图15A）。与WT肝细胞相比，Cox10−/−肝细胞的FAO活性降低，在PHx2天后没有增加（辅图15B）。同时，研究人员观察到，与PHx后能够维持和增加乙酰辅酶A的WT肝脏相比，在Cox10−/−再生肝脏中乙酰辅酶A水平大幅下降（图4J）。除了产生能量外，乙酰辅酶A还有多种作用，研究人员观察到在再生的Cox10−/−肝脏中组蛋白乙酰化降低，包括细胞关键周期基因在内的多个基因组位点上的H3K27乙酰化标记减少（辅图15C-E）。这些数据表明脂肪酸氧化是再生肝脏中乙酰辅酶A的主要来源，并且在复合体IV抑制的情况下受损。
图4 在肝脏再生过程中，外周脂肪酸的氧化受到刺激
辅图11 再生肝脏中的脂肪酸积累
辅图12 7周D2O示踪和肝脏再生后肝脏脂肪酸的同位素丰度
辅图13 D2O示踪和肝脏再生过程中肝脏脂肪酸质量同位素分布
辅图14 肝脏再生过程中D2O追踪脂肪酸氧化产物
辅图15 再生过程中肝脏中Cox10-/-组蛋白乙酰化降低
5
外周脂肪酸氧化促进肝细胞再生
辅图16 脂解抑制剂阻止肝脏PDK4的积累
拓展阅读
HADHA
HADHA，全称为羟酰辅酶A脱氢酶三功能多酶复合物亚基α（Hydroxyacyl-CoA Dehydrogenase Trifunctional Multienzyme Complex Subunit Alpha），和HADHB一起作为线粒体三功能蛋白(MTP)的重要亚基部分。在脂肪酸代谢中，MTP参与了脂肪酸β氧化的第二、第三和第四步，分别对应MTP的三个功能：2-烯酰基CoA的水合、长链-3-羟酰基CoA的脱氢以及β-酮脂酰的硫解。其中HADHA主要影响了第二、三步。其次，HADHA也具有单聚心磷脂酰基转移酶活性，可以将单聚心磷脂酰化为心磷脂，而心磷脂又是线粒体主要的膜磷脂之一，在细胞凋亡中起着关键的作用，支持线粒体呼吸链复合物产生ATP。另外，HADHA还是肝脏糖异生紊乱的关键抑制因子。正常情况下，肝脏HADHA促进脂肪酸β氧化生成乙酰辅酶A，乙酰辅酶A再经一系列反应生成酮，BHB是主要的一种酮体，依赖于HADHA。BHB可以结合HDAC7并抑制其活性，从而保持FOXO1的乙酰化和磷酸化。在糖尿病患者中，过量的胰高血糖素损害HADHA的表达并抑制下游BHB的产生，从而通过激活HDAC7增加FOXO1转录活性和肝脏糖异生。
参考文献：
[1]Wang, X., et al. Molecular medicine reports, 26(6), 355.
[2]Pan, A., et al. Nature communications, 13(1), 386.
6
代谢不灵活性抑制线粒体ETC功能障碍的肝细胞的增殖
为了探究非脂肪酸来源乙酰辅酶A产生受到抑制的机制，研究人员评估了丙酮酸和乙酸代谢中关键酶的表达。PDH活性（丙酮酸转化为乙酸盐所必需的）由一组激酶（PDK1,2,3和4）调节，结果显示在PHx2天后，Cox10−/−肝脏中PDK4水平显著升高，这与PDH第300位的丝氨酸磷酸化增加相关（图6E）。研究人员还观察到PHx后WT肝脏中ACSS1和ACSS2（从乙酸合成乙酰辅酶A所需的代谢酶）的抑制。在Cox10−/−肝脏中，ACSS1和ACSS2水平进一步受到抑制（图6E）。研究人员在Sdha−/−、Uqcrq−/−和Atp5f1a−/−以及sgHadha肝脏中观察到类似的酶变化模式（辅图17H），表明这些变化可能是由于脂肪酸氧化缺陷引起的。因此，研究人员假设Cox10−/−肝脏中的脂肪酸积累是PHx后PDK4的诱导和ACSS2抑制的原因。为了验证这一点，研究人员检测了用ATGL和HSL抑制剂（可以阻止周围脂肪的动员）处理的小鼠肝脏（图5）。ATGLi+HSLi处理抑制了WT和Cox10−/−肝脏中PDK4的水平，并促进了ACSS2的表达（图6F），表明PHx后脂肪酸转移到肝脏抑制了非脂肪酸来源的乙酰辅酶A的产生。与此一致的是，研究人员观察到用ATGLi和HSLi处理的Cox10−/−动物的肝细胞增殖增加（图6G、H），支持脂肪酸积累通过限制线粒体和细胞质室中乙酰辅酶A产生的替代途径来抑制肝脏再生的模型（图6I）。
为了检验该模型，研究人员使用了二氯乙酸（DCA）（小编注：二氯乙酸是一种丙酮酸类似物，已知丙酮酸结合位点位于N 末端结构的螺旋束内部，平时被水分子掩盖；在生理状态下，高浓度的丙酮酸进入PDKs上丙酮酸结合位点，下调PDKs活性，促进PDH功能，转而促进氧化磷酸化进程；DCA 结合在丙酮酸结合位点，导致该位点中的His149 向螺旋束外部发生位移，促进螺旋结构的解开，从而抑制PDKs 的活性）处理，这是一种强大且生物可用的PDK4抑制剂，它足以消除Cox10−/−肝脏中PDH在第300位丝氨酸的磷酸化（图7A、B）。在使用DCA处理的[U-13C]葡萄糖输注的Cox10−/−动物中，研究人员观察到与同窝对照WT小鼠相比，葡萄糖对乙酰辅酶A的贡献显著增加（P = 3.9×10−7）。以及乙酰辅酶A m+2 /丙酮酸m+3比率和乙酰辅酶A稳态水平的大幅增加（图7C、D，辅图18A-C）。这种效果伴随着PHx2天后的增殖能力恢复（图7E、F）。研究人员使用另一种PDK抑制剂（PS10）（小编注：PS10即2-（4-甲磺酰基-2-亚硝基苯甲酰基）环己烷-1,3-二酮是一种新型有效且具有ATP竞争性的广谱PDK抑制剂，能够结合GHKL ATP 酶/激酶超基因家族的保守ATP 结合位点，该结合位点位是由1个β折叠和3个α螺旋组成的一种叫做“Bergerat 折叠”的特定模序结构，该抑制剂的使用导致ATP 结合亲和力下降、位点活性丧失，降低细胞能量供给。GHKL ATP 酶/激酶超基因家族是一个包含多种蛋白质家族的ATP结合超家族，其中包括DNA拓扑异构酶II、分子伴侣Hsp90、DNA错配修复酶MutL和组氨酸激酶等，PDK并不直接被归类为GHKL超家族的成员，但两者都涉及到ATP结合和利用ATP进行磷酸化反应的生物学过程。PDK作为代谢途径中的关键调节酶，与GHKL超家族中成员的功能有相似之处，即通过ATP依赖的方式进行生物学调控）重复了这些实验，结果相似（辅图19A-D）。由于这些药物抑制多种PDK家族成员，研究人员还检测了Cas9介导的敲除Cox10和Pdk1, Pdk2, Pdk3或Pdk4后的肝细胞反应（图7G、H）。对照sgRNAs不损害肝部分切除术后肝细胞的增殖，而针对Cox10 （sgCox10）的sgRNAs抑制了增殖（图7G）。使用Cas9介导同时敲除sgCox10和Pdk1、Pdk2或Pdk3并没有增加肝细胞的增殖（辅图19E）。然而，靶向Pdk4 （sgPdk4#1或sgPdk4#2）的sgRNAs与sgCox10同时表达可恢复肝细胞增殖（图7I、J）。
这些结果表明，尽管线粒体ETC功能障碍持续存在，但去除Cox10−/−肝脏中Pdk4的活性足以促进肝细胞增殖。这些结果表明，由于肝细胞ETC功能障碍而导致的脂肪酸氧化抑制，进而影响了代谢灵活性。原则上，抑制代谢灵活性可能是阻止线粒体ETC功能障碍的肝细胞增殖的机制。具体来说，在线粒体ETC功能障碍的情况下，脂肪酸的积累会诱导PDK4并抑制ACSS2（小编注：PDK4是丙酮酸脱氢酶激酶家族的成员之一，它通过磷酸化并抑制丙酮酸脱氢酶（PDH）的活性，影响丙酮酸转化为乙酰辅酶A的过程。而ACSS2是乙酰辅酶A合成酶家族的重要成员，它能够催化乙酸转化为乙酰辅酶A，参与细胞内的能量代谢和乙酰化过程的调节。具体来说，PDK4通过抑制PDH的活性，减少乙酰辅酶A的生成，而ACSS2则利用细胞内的乙酸合成乙酰辅酶A。脂肪酸积累抑制ACSS2的表达，因为ACSS2是催化乙酸转化为乙酰辅酶A的关键酶，而乙酰辅酶A是脂肪酸合成的前体。当脂肪酸积累到一定程度时，可能会通过负反馈机制抑制ACSS2的活性或表达，以减少脂肪酸的进一步合成），从而限制了这些细胞的代谢灵活性（图6I）。为了验证这一点，研究人员通过低剂量注射AAV-Cre敲低了大约5%的肝细胞中的II、III、IV或V复合体的ETC组分。（类似于图2A-C），并检测了在肝再生过程中全身性抑制PDK4对肝细胞增殖的影响（图7K）。在对照组中，Sdha、Cox10、Uqcrq和Atp5f1a基因敲除的小鼠中肝细胞没有增加，并像之前的结果一样逐渐被再生肝细胞所替代(辅图19F)。在DCA或PS10处理的Sdha、Cox10、Uqcrq和Atp5f1a基因敲除小鼠中，肝细胞增加，促进肝脏再生(图7L、M，辅图19 G-I)。这些结果表明，代谢灵活性降低是阻止ETC功能失调的肝细胞扩增的机制。
图6 脂肪酸积累抑制乙酰辅酶A的产生
图7 PDK4抑制可促进ETC功能障碍肝细胞的增殖
辅图17 Cox10−/−肝脏再生过程中从葡萄糖和乙酸产生的乙酰辅酶A被抑制
辅图18 二氯乙酸（DCA）抑制PDK促进葡萄糖氧化成乙酰辅酶A
辅图19 PS10治疗促进Cox10−/−小鼠的肝脏再生
总结
线粒体电子传递链（ETC）功能障碍常见于人类获得性疾病，包括代谢相关肝病。在肝脏再生过程中，增殖的肝细胞相互竞争，使适应能力增强的细胞更容易为再生器官的组成做出贡献。近期研究表明，线粒体ETC功能可以影响肝细胞行为，但ETC是否影响肝损伤后肝细胞的增殖，从而有助于肝器官的恢复状态和功能尚不清楚。本文作者在小鼠中使用线粒体代谢物谱和同位素示踪技术来研究稳态和再生条件下肝细胞的代谢反应。并且使用了一组针对线粒体ETC基因敲除小鼠模型来探究每个ETC复合体（I到V）对肝脏再生的贡献。通过这种方法，研究人员发现在ETC失调的情况下，小鼠肝脏迅速积累脂肪酸，导致脂肪变性；而在ETC复合体敲除小鼠肝脏再生过程中，胆管细胞向肝细胞转分化从而促进肝脏再生。代谢追踪研究表明，WT肝脏在增殖过程中依赖于外周脂肪的动员和氧化来维持乙酰辅酶A水平。在ETC复合体敲除小鼠肝脏中，脂肪酸氧化被抑制，导致脂肪酸堆积，乙酰辅酶A的产生减少。值得注意的是，肝细胞增殖不需要线粒体复合体I，这表明复合体I不是再生肝细胞ETC的主要电子供体（小编注：复合体II除了参与电子传递链外，还参与柠檬酸循环，并且其突变与肿瘤的发生密切相关。其次，复合体II与其余几个复合体的功能区别在于它并不转运质子，可以将其视为电子传递链的一个旁路，因此推测复合体II可能还存在着其他潜在的功能）。当脂肪酸在ETC功能障碍的情况下积累时，由于PDK4的诱导表达和ACSS2的表达减少，非脂肪酸来源的乙酰辅酶A的生成受到抑制。这种代谢的不灵活性迫使再生过程依赖于脂肪酸氧化，促使具有功能性ETC的肝细胞进行增殖。
原文链接：https://www.science.org/doi/10.1126/science.adj4301?url_ver=Z39.88-2003&rfr_id=ori:rid:crossref.org&rfr_dat=cr_pub%20%200pubmed
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