校对 | 生茂正
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治疗NASH药物作用机制
目前NAFLD的治疗策略主要是通过增加身体活动和减少食物摄入以促进体重减轻。然而大约80%通过改变生活方式减肥的人们体重会反弹，这说明需要额外的治疗手段进行干预。最近一项大规模的人类外显子组测序研究报告显示孤儿G蛋白偶联受体75(G protein-coupled receptor 75,Gpr75)突变与较低的体脂和BMI相关，因此科研人员对该受体产生强烈兴趣。目前已有研究发现在小鼠中靶向抑制Gpr75能够预防饮食诱导的肥胖，这表明该受体在调节体重的过程中具有重要作用。鉴于部分基因的缺失减轻肥胖的同时能够导致脂肪萎缩和脂质异位堆积，增强脂肪肝风险（小编注：本文作者并未对所提出的这一结论给出参考文献。23年iScience曾报道磷脂合成关键酶Agpat2敲除可引起脂肪萎缩和脂质代谢紊乱，增加肝脂肪变性和糖尿病风险，并验证了该基因在脂肪分化中的重要作用。但目前大多数研究认为导致肥胖的基因缺失能够促进能量代谢，主要通过增强脂质代谢减轻肥胖和脂肪肝，如24年发表的Nature Metabolism发现白色脂肪细胞特异性RalA基因缺失能够增强能量消耗，进而减轻HFD条件下的肥胖和脂肪肝），因此确定GPR75缺失对肝脏脂质积累的影响至关重要。为了解决这一问题，英国阿伯丁大学的Lora K. Heisler团队进行相关研究，其成果“Loss of GPR75 protects against non-alcoholic fatty liver disease and body fat accumulation”近期发表在Cell Metabolism上，该研究发现Gpr75 KO小鼠在HFD喂养下，能够通过调整热量摄入和能量消耗而保持能量平衡。人类Gpr75功能缺失性突变以性别依赖的方式影响脂质沉积，Gpr75突变与肝脏脂肪变性呈负相关。
1、下丘脑RNA-seq显示Gpr75与促食欲神经元共表达
2、Gpr75 KO小鼠通过抑制HFD食物摄入量保持能量平衡
3、在Gpr75突变的人类和小鼠中检测到肥胖特征的性别效应
4、人类和小鼠中Gpr75的突变可以预防脂肪肝疾病
研究结果
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研究人员首先分析了小鼠中Gpr75 mRNA的表达情况，发现其在大脑中表达水平最高，在肝脏中几乎不表达(图1A)。鉴于Gpr75在大脑中的丰度，研究人员使用原位杂交(RNAScope)绘制了Gpr75 mRNA表达图谱，发现其广泛分布于整个大脑，包括但不限于与能量稳态相关的区域，如下丘脑（小编注：RNAscope技术可以在单张切片上同时检测多个RNA靶标，也兼容和免疫荧光的共染，同时能够展示非编码 RNA 在胞核或者胞膜上的定位情况，使用RNAscope能够对细胞的转录模式进行灵敏的空间和定量分析。此外，神经元中受体靶点较多，这些受体通常在胞外暴露的特异性氨基酸序列较少，难以通过抗体检测，因此通常以RNAscope为替代手段。目前RNAscope技术广泛应于无抗体靶点如各种受体靶点的鉴定和表征以及神经元细胞亚群的组织分布或新神经元的表征）(图S1)。
图1.Gpr75表达的表征
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为了探究Gpr75是否能够调控食欲，研究人员使用CRISPR-Cas9方法在Gpr75中产生5个碱基对的缺失，使得Gpr75序列提前终止(图2A、B)，从而生成了Gpr75 KO小鼠。研究人员发现雄性和雌性Gpr75 KO小鼠在NCD喂养时热量摄入与WT小鼠相似(图2D-G)，而在HFD喂养时，雄性和雌性Gpr75 KO小鼠减少摄食量，使得热量摄入量与NCD饮食相当。当WT和Gpr75 KO小鼠在对两种饮食进行选择时，两组小鼠均更偏好于HFD饮食，这表明HFD摄入量的降低与小鼠的饮食偏好无关(图S2N、O)。相比之下，WT小鼠在HFD喂养时的每日热量摄入量显著增加(图2D-G)，进而促进肥胖(图3)。随后研究人员进行了膳食模式分析，以探究小鼠在提供两种不同饮食情况下的摄食行为，结果发现与NCD喂养相比，WT和Gpr75 KO小鼠在HFD喂养时，每日的进食量和进食时间均减少，这与高热量食物产生的热量和饱腹感更高相一致(图2H、I)。与NCD喂养相比，HFD喂养的WT小鼠的进食频率更高(图2J)同时进食间隔时间更短(图2K)，进而导致HFD喂养下每日的热量摄入量增加(图2D-G)。而Gpr75 KO小鼠在HFD喂养下调整了进食量和进食时间，但没有改变进食频率和进食间隔(图2H-L)。以上数据表明，在HFD喂养下，Gpr75 KO小鼠摄入热量降低以维持能量代谢平衡。
研究人员还对WT和Gpr75 KO小鼠的能量消耗进行研究，发现雌性和雄性Gpr75 KO小鼠的身体活动明显增加(图2M-P、图S2A-D)，特别是在刚进入黑暗阶段时(图S2H-K)。当小鼠被NCD喂养或急性HFD喂养4天后，在每日能量消耗方面没有检测到基因型之间的总体差异 (图2Q、R)。研究人员对HFD喂养4-5个月的小鼠的能量消耗也进行了量化，结果发现最低代谢率（MMR;测量72小时内数值最低的20分钟）（小编注：作者在本文中使用MMR值来表征小鼠在完全静息情况下的基础代谢率，由于该数值可以排除活动等其他条件造成的影响，且仅和Lean Mass正相关，因此作者在后文中使用实时代谢率和MMR的比值用以消除小鼠的个体差异）与瘦体重显著相关，但不受性别或基因型的影响（图S2E）。在雌性小鼠中，测量的实时代谢率/MMR比值（小编注：此处作者把MMR作为代谢率基准，因为MMR仅和Lean Mass正相关，因此使用实时代谢率/MMR比值定量能量消耗情况，可以排除小鼠间的个体差异）显示黑暗周期比光照周期消耗更多的能量(图S2F)。除此之外，基因型也有很大影响，与WT小鼠相比，雌性Gpr75 KO小鼠在光照和黑暗周期中都具有更高的能量消耗(图S2J)，这种效应在雄性小鼠中没有达到统计学意义（图S2G）。然而由于KO小鼠身体活动量显著增加，因此研究人员认为能量消耗的小幅增加仍然可能具有生理意义（图S2H、I）。研究人员通过进一步的统计分析发现，与雄性Gpr75 KO小鼠相比，雌性Gpr75 KO小鼠活动更活跃(图S2M)。此外，与WT小鼠相比，雌性Gpr75 KO小鼠在黑暗阶段的能量消耗增加更大(图S2J)。以上数据表明，与WT小鼠相比，HFD喂养的Gpr75 KO小鼠在黑暗阶段的身体活动更加活跃，这与其在黑暗周期能量消耗升高相一致。
图2.Gpr75 KO小鼠在HFD饮食中表现出食物摄入量减少和活动增加
图S2.HFD喂养的WT和Gpr75 KO小鼠的能量平衡和食物选择
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由于Gpr75 KO小鼠在NCD饮食中表现出与WT小鼠相似的热量摄入和能量消耗水平，研究人员在NCD饮食下探究肥胖状态的基因型差异。研究人员对NCD喂养的WT和Gpr75 KO小鼠进行了为期4-5个月的体重和体脂监测，发现在NCD喂养下，雄性Gpr75 KO小鼠的体重与WT小鼠相当，而雌性Gpr75 KO小鼠的体重略低于WT小鼠。但在体脂方面，两种小鼠具有较大差异，雄性和雌性NCD喂养的Gpr75 KO小鼠的总脂肪量显著降低，内脏和皮下脂肪垫重量的减少尤为明显(图S3A-P)。
研究人员探究了HFD喂养对Gpr75 KO小鼠体重和脂质积累的影响。研究发现与HFD喂养的WT小鼠体重显著增加，而与WT小鼠相比，雄性Gpr75 KO小鼠体重增加量减少了50%，雌性Gpr75 KO小鼠减少了76%(图3A、F)。与WT小鼠相比，雄性Gpr75 KO小鼠在HFD喂养下增加的脂肪量减少了35%，雌性小鼠减少了74%。(图3B、G、图S3Q-V)，并且在内脏和皮下脂肪组织库中均发现了脂质的减少(图3D、E、I、J)。性别比较显示，HFD喂养的雌性Gpr75 KO小鼠体重和体脂的增加程度明显少于雄性Gpr75 KO小鼠(图3K、L)。内脏脂肪的组织学分析显示，HFD喂养的雌性Gpr75 KO小鼠的脂肪细胞发生了显著变化，而在NCD喂养的雌性Gpr75 KO小鼠、NCD喂养的雄性Gpr75 KO小鼠、HFD喂养的雄性Gpr75 KO小鼠中的变化并不明显(图3M)。研究人员通过qPCR分析发现HFD喂养的雌性Gpr75 KO小鼠的白色脂肪组织具有组织学上的棕色化特征(图3M-S)，HFD喂养的雄性Gpr75 KO小鼠产热基因表达水平和组织学结果均未发生显著变化(图S4C、D)。与WT小鼠相比，Gpr75 KO小鼠的棕色脂肪组织未发现显著变化(图S4B、E、F)。进一步的身体成分分析显示，与WT小鼠相比，雌性Gpr75 KO小鼠具有更高的骨矿物质含量和密度(图S4H、J)。这些数据表明，Gpr75功能的扰动可以保护雄性和雌性小鼠免受体重增加的影响，即使在HFD饮食下，这种表型也会保留，并且在雌性小鼠中更为明显。
图3.Gpr75的缺失与小鼠和人类的肥胖程度降低有关
图S3.NCD和HFD喂养的Gpr75 KO小鼠体脂减少
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最近一份研究发现GPR75功能缺失突变与645,626人的BMI和全身脂肪较低具有相关性（小编注：2021年Science 中研究人员对 640,000 个外显子组进行测序分析以及功能缺失突变的预测结果发现GPR75具有46个罕见的预测功能缺失突变体，同时研究人员确定了46 个 LOF 变体在 GPR75 蛋白上的分布，其功能缺失归因于GPR75蛋白的截短突变，在46个LOF突变中有45个与较低BMI相关。本文引用21年Science鉴定出的LOF突变进行实验）。基于上述小鼠模型实验，研究人员推测GPR75可能对身体脂肪沉积具有性别二态效应。研究人员使用由428,719个欧洲血统个体组成的公开可用的UKBB外显子组，鉴定出145个个体(68个男性和77个女性)在GPR75编码区携带功能丧失(Loss-of-function,LOF)突变。并且研究人员证实与该组的非突变携带者相比，GPR75 LOF携带者具有较低的总体脂百分比。接下来，研究人员检查了不同性别的总体脂百分比，发现GPR75 LOF携带者中体脂百分比与BMI的变化与性别无关(图3T、图S4L、M)。当研究人员使用腰臀比WHR作为替代指标检查GPR75 LOF对体脂分布的影响时，在调整BMI后，GPR75 LOF突变与女性较高的WHR相关，而这种影响在男性中并不存在(图3U)。上述结果表明GPR75 LOF突变可能以性别依赖的方式影响人体内脂肪沉积。
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总结
在本研究中，研究人员发现GPR75大量表达参与食欲调节的下丘脑神经元细胞亚群。在HFD喂养下，Gpr75 KO小鼠能够通过调整热量摄入和能量消耗以保持机体的脂类代谢维持稳定能量平衡，从而预防NAFLD的发生。通过对人类样本的大规模全外显子测序数据分析表明，GPR75缺失突变与肝脏脂肪变性呈负相关，因此该研究表明GPR75可能是NAFLD治疗的潜在药物靶点。
原文链接：https://www.cell.com/cell-metabolism/fulltext/S1550-4131(24)00120-7
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