点击上方“蓝字”关注我们
撰文 | 李欣茜 郑宇含 张彦康 张婷 仲银召 李雨
编辑 | 孟美瑶
校对 | 张婷
背景介绍
衰老是一个不可避免的过程，随着时间的推移，最终导致细胞稳态和自我修复能力的逐步丧失，进而导致全身生理功能的下降。许多与衰老相关的慢性疾病，如心血管疾病、糖尿病、神经退行性疾病和癌症，给医疗保健系统带来了巨大的负担。因此，探究衰老的基本机制，寻找对抗衰老和治疗衰老相关疾病的方法是非常必要的。
从机制上来看，衰老过程主要归因于细胞、细胞器和大分子随机损伤的逐步积累。但损伤的确切机制尚不完全清楚，可能与细胞自主过程相关，包括基因组不稳定、端粒磨损、表观遗传改变、蛋白质稳态丧失、营养感知失调、线粒体功能障碍、细胞衰老和干细胞衰竭。然而，非细胞自主机制，特别是细胞间或组织间交流的改变，对衰老也有着至关重要的影响。组织间的有效交流依托于血液流动造就的环境因素，这对维持整个身体的健康状态至关重要。因此，衰老相关疾病的发生被认为是由组织间交流受损引起的，且血液中循环分子是主要贡献因子。最近的研究表明，在异体共生(一种将两只不同年龄动物的循环系统连接在一起的外科手术)实验中，来自年轻小鼠的血液能使衰老小鼠的大脑、心脏、肝脏、胰腺、肾脏、骨骼肌和骨骼恢复活力。随后几项研究进一步表明，血浆输注能重现异体共生模型中血液共循环所造成的表型。从此，人们一直致力于寻找血浆中与逆转年龄相关损伤有关的因子。迄今为止，已经发现了几种存在于年轻血浆中的年轻化因子(也称为血源性因子、促青春因子或抗衰老因子)。然而，这些血浆因子发挥作用的确切机制尚未明晰。
拓展阅读
[1] Loffredo FS, et al. Cell. 2013 May 9;153(4):828-39.
[2] Moigneu C, et al. Nat Aging. 2023 Feb;3(2):213-228.
[3] Das MM, et al. Commun Biol. 2019 Feb 20;2:73.
[4] Castellano JM, et al. Nature. 2017 Apr 27;544(7651):488-492.
[5] Khrimian L, et al. J Exp Med. 2017 Oct 2;214(10):2859-2873.
[6] Schroer AB, et al. Nature. 2023 Aug;620(7976):1071-1079
在过去十年中，细胞外囊泡（EV）介导的细胞间通讯为我们对多细胞生物遗传信息传递和稳态维持的认识增加了一个新的维度。EV是一类异质性纳米膜囊泡，由富含蛋白质的脂质双分子层和来自EV产生细胞的蛋白质和RNA组成。EVs 通过血液循环输送至全身，是细胞间通信网络的信使，促进供体细胞和受体细胞之间的物质传递。由于血液中存在大量具有生物活性的EVs，而且EVs会对全身生理机能和稳态造成多方面的影响，因此血液中的EVs可能会通过一种非细胞自主机制来介导衰老过程，并作为关键介质参与年轻血液改善衰老组织功能的过程。在这项研究中，研究人员重点研究了小细胞外囊泡（sEVs，<200 nm），并通过向衰老小鼠多次注射来自年轻小鼠或人类的sEVs探索其年轻化作用。此外，研究人员还利用体内和体外模型，进一步阐明了年轻sEVs在逆转与年龄有关的损伤和退行性变化方面发挥关键作用的分子基础。
研究结果
1
首先，研究人员分别从年轻（2月龄）和衰老（20月龄）雄性小鼠血浆中纯化sEVs（小编注：本文采用超速离心的方法纯化sEV。首先用等体积PBS稀释血浆，然后在4°C条件下以以下转速和时间依次离心：500g离心5分钟，3000g离心25分钟，12000g离心60分钟，最后120000g离心70分钟，收集sEV沉淀。然后利用外泌体分离试剂盒（Invitrogen，沉淀法）进一步处理上清，获取sEV，提高sEV纯化效率。此种纯化方法从1mL血浆中可以获得约1000μg总蛋白含量的sEV），并通过纳米颗粒跟踪分析（NTA），发现年轻和衰老小鼠血浆中sEVs的数量级相同（年轻血浆中sEVs为1.7×109粒子/毫升，衰老血浆中sEVs为1.04×109粒子/毫升），同时颗粒大小相近（在约100 nm处达到峰值）（图S1a）。透射电镜（TEM）结果表明纯化后的年轻sEVs具有正常sEVs的形态特征和大小（图S1b）。WB结果显示，在纯化的年轻sEVs和衰老sEVs中经典sEVs标记物（CD9、CD63、Alix和Tsg101）高度富集，并且没有检测到主要的血浆蛋白（Albumin）和内质网蛋白（Calnexin）（图S1c），这表明纯化的sEVs未被血浆和细胞内组分污染。
为了探究从年轻小鼠血浆纯化的sEVs是否能延长衰老小鼠寿命，研究人员向20月龄衰老雄性小鼠每周静脉注射1次PBS或年轻sEVs（小编注：研究人员根据sEVs中的总蛋白含量定量，用PBS将提取的sEV稀释到蛋白浓度为1.80μg/μl，每次注射200ul，共注射含360μg蛋白的sEVs。由于研究人员的纯化方式从1mL血浆中可以获得约1000μg总蛋白含量的sEVs，因此换算下来每只小鼠每次注射量相当于0.36mL年轻小鼠血浆），直至小鼠死亡。结果表明，每周注射年轻sEVs可使衰老小鼠的中位寿命显著延长12.42%（注射年轻sEVs的小鼠寿命为34.4个月，注射PBS的小鼠为30.6个月）（图1a）。通常情况下年轻小鼠背部的毛发乌黑有光泽，衰老小鼠则毛发灰白且伴有脱落，而年轻sEVs治疗使衰老小鼠外观看起来更健康，基本阻止了衰老小鼠的毛发脱落现象（图1b）。
衰弱是一种衰老相关的综合征，其特点是许多生理系统功能衰退，导致体内平衡失调，更容易对健康造成不良影响。此前的研究建立了一套不对小鼠造成侵入性伤害的衰弱评估体系，即通过临床评估来量化衰老小鼠的衰弱状态。依照这一客观指标，研究人员发现衰老小鼠的平均衰弱指数得分远高于年轻小鼠，而用年轻sEVs治疗能够明显降低衰老小鼠的衰弱指数（图1c），这使sEVs治疗的衰老小鼠的生物年龄（与生理退化程度相符的估计年龄，而非实际年龄）仅为15.1个月，而它们的实际年龄为24个月。特别的是，年轻sEVs治疗明显改善了衰老小鼠所有具有缺陷的临床症状，其中对皮肤和肌肉骨骼系统的改善最明显。
拓展阅读
[1] Whitehead JC, et al. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 2014 Jun;69(6):621-32.
图S1.表征纯化sEVs
图1.年轻sEVs长期治疗对衰老小鼠寿命和全身生理的影响
2
年轻sEVs长期治疗对全身生理的影响
图S2.年轻sEVs长期治疗对衰老小鼠全身生理产生的影响
3
图S4.注射衰老sEVs对衰老和年轻小鼠记忆能力和耐力的影响
图S5.短期注射年轻/衰老血浆对衰老/年轻小鼠认知功能和耐力的影响
4
接下来，研究人员检测了年轻sEVs短期治疗的衰老小鼠衰老相关表型的变化。据报道，衰老细胞通常会表达衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal），因此可用SA-β-Gal表征细胞是否处于衰老状态。与年轻小鼠相比，衰老小鼠的肝脏、脾、肺、肾、海马和睾丸中SA-β-gal活性显著升高，而年轻sEVs短期治疗能迅速降低衰老小鼠各组织中的SA-β-gal水平（图2f）。此外，与年轻小鼠相比，衰老小鼠各组织中细胞周期抑制因子p21和p16的表达水平升高（图S6a,b），但年轻sEVs短期治疗显著降低了p21和p16表达水平（图2g和图S6c）。此外，有研究表明衰老细胞不能增殖，因此研究人员检测了小鼠海马中内源性细胞增殖标志物Ki67的表达，发现与年轻小鼠相比，衰老小鼠海马中Ki67阳性细胞比例明显降低，而年轻sEVs短期治疗的衰老小鼠海马中Ki67阳性增殖细胞明显增多（小编注：海马神经元的发生过程包括神经干细胞的增殖以及向神经元和胶质细胞的分化，而成熟神经元不具备增殖能力）（图2h和图S6d）。有研究表明，衰老细胞线粒体功能失调会导致活性氧（ROS）水平升高。在此，研究人员发现与年轻小鼠相比，衰老小鼠各组织中ROS水平显著升高，而年轻sEVs短期治疗能使衰老小鼠ROS水平恢复到与年轻小鼠相似的正常水平（图2i）。晚期糖基化终末产物（AGE）是由糖的酮基或醛基与蛋白质的氨基发生非酶反应而形成的，其积累是衰老或退行性疾病的标志。在此，研究人员发现衰老小鼠各组织中AGE积累明显增多，但年轻sEVs短期治疗能迅速消除衰老小鼠体内AGE的过量积累（图 2j）。同样的，脂褐素是一种随着年龄的增长而在有丝分裂后细胞的溶酶体中积累的色素，研究人员发现衰老小鼠的肝、心、肾和海马的脂褐素积累增多，但给衰老小鼠短期注射年轻sEVs后，这些组织中脂褐素聚集明显减少（图 2k）。
另一方面，长期注射年轻sEVs也能有效恢复衰老组织活力，抑制细胞衰老。如SA-β-gal染色所示，经年轻sEVs长期治疗的衰老小鼠各组织中SA-β-gal活性明显降低 （图S7a），同时各组织中p21和p16的表达水平也明显降低（图S7b-c）。
拓展阅读
[1] Ott C, et al. Redox Biol. 2014 Jan 9;2:411-29.
5
图S8.iTRAQ定量蛋白质组学数据的UMAP图（注射PBS和年轻sEVs的衰老小鼠的8种组织）
6
线粒体是细胞内普遍存在的细胞器，主要作用是为细胞提供三磷酸腺苷（ATP），在细胞代谢中起核心作用，同时也是衰老过程中最常受损的细胞器。随着年龄的增长，线粒体发生损伤，ATP产量逐渐减少，线粒体DNA（mtDNA）也会累积损伤，最终导致各种组织的代谢异常和功能衰退。蛋白质组分析显示，年轻sEVs治疗的衰老小鼠中蛋白质组的改变主要与“代谢”相关，于是研究人员分析了这些小鼠线粒体功能和代谢表型的变化。结果显示，与年轻小鼠相比，衰老小鼠海马和肌肉中ATP合成、线粒体呼吸链复合体V（CⅤ）活性和mtDNA拷贝数明显降低，而年轻sEVs短期治疗能显著促进衰老小鼠海马和肌肉中ATP合成、CⅤ活性和mtDNA拷贝数（图4a-f和图S9a-b）。此外，短期注射年轻sEVs也能减少衰老小鼠心脏、肝脏、脾、肺、肾和睾丸中mtDNA含量的损失（图S9c-h）。相反，衰老sEVs则无法改善衰老小鼠各组织中的ATP生成、CⅤ活性和mtDNA含量（图S10a-f），这进一步证实了年轻而非衰老sEVs能改善线粒体能量代谢（小编注：mtDNA是线粒体内相对独立的基因组，负责编码13个与呼吸链组成相关的关键亚基、2个rRNA和22个tRNA。mtDN拷贝数减少会损害线粒体蛋白的表达，引起线粒体氧化磷酸化功能受损，降低线粒体ATP产生和质量。mtDNA拷贝数受mtDNA复制转录体、氧化应激水平和线粒体自噬调控。研究表明TFAM是启动mtDNA复制过程的重要调节因子，TFAM缺失会导致胚胎mtDNA拷贝数减少42%，并引起线粒体ATP合成降低50±22%。氧化应激对mtDNA拷贝数具有双重作用，轻度氧化应激会促进mtDNA转录，提高mtDNA拷贝数，代偿性增强线粒体呼吸功能，重度氧化应激会导致线粒体损伤程度超过线粒体自我调控能力，引起mtDNA拷贝数下降，线粒体功能发生障碍。线粒体自噬是清除受损或冗余线粒体的重要途径，会引起mtDNA拷贝数的下降，是mtDNA的一种降解机制）。
据报道，在衰老细胞中会逐渐累积嵴缺失或异常堆叠的受损线粒体。为了探究年轻sEVs对线粒体质量和形态的影响，研究人员用TEM观察线粒体，发现与年轻小鼠相比，衰老小鼠海马和肌肉中的线粒体数量较少且有较多线粒体肿胀或破碎，而年轻sEVs短期治疗的衰老小鼠海马和肌肉中的线粒体数量明显增多且异常结构线粒体比例下降（图 4g-j）。此外，年轻sEVs治疗也能增加衰老小鼠心脏、肝脏、脾、肺、肾中线粒体的数量，改善线粒体肿胀和线粒体基质破碎情况（图S11）。随后，为了观察肌纤维中线粒体的分布，研究人员用SDHA（线粒体呼吸链复合物II主要的催化亚基，可作为线粒体标志物）和Desmin（肌源性标志物）共染小鼠肌肉组织，发现与年轻小鼠相比，衰老小鼠肌肉中SDHA含量明显降低，而年轻sEVs短期治疗能显著促进肌肉中SDHA含量（图4k-l），表明年轻sEVs治疗促进衰老组织中线粒体含量（小编注：从图S8来看，UMAP分析的结果中只有脾、海马和肺部样本中蛋白质组存在整体差异，肌肉蛋白质组整体差异不大。UMAP分析是一种非线性降维和可视化算法，其优点是能在重叠区域中表现出不同的集群，体现集群整体的分离情况，但在此过程中也会丢失一些信息。因此单从S8的结果并不能认为肌肉蛋白质组没有差异。事实上，从图3c和3e来看，肌肉蛋白质组在许多通路上是存在明显差异的）。总之，这些结果表明，年轻sEVs可以增加线粒体含量，维持线粒体功能，从而增加ATP供应，弥补衰老组织线粒体缺陷。此外，研究人员发现衰老sEVs处理会显著抑制年轻小鼠海马和肌肉中细胞ATP合成、 CⅤ活性和mtDNA含量显著降低（图S10g-l），并且会导致线粒体数量减少和线粒体结构受损（图S10m-p）。这些结果表明，衰老sEVs会加剧小鼠组织中线粒体的损伤，从而导致能量缺乏。
图S10.衰老sEVs处理对衰老和年轻小鼠代谢表型的影响
图S11.年轻sEVs治疗改善衰老小鼠各组织线粒体结构
7
为了探究年轻sEVs对细胞能量代谢的恢复作用，研究人员用年轻sEVs处理神经上皮细胞（NE-4C）和肌源性细胞（C2C12）（图S12a），发现年轻sEVs处理显著促进了NE-4C和C2C12细胞中ATP合成、CV活性和mtDNA拷贝（图S12b-g）。此外，年轻sEVs处理能显著促进两种细胞的基础耗氧率（OCR）、ATP偶联OCR和最大OCR（图S12h-k），表明细胞中氧化磷酸化（OXPHOS）和电子传递活性显著增强。此外，年轻sEVs能抑制这两种细胞衰老，恢复细胞增殖能力（图S12l-q）。
为了进一步证实年轻sEVs能够改善衰老线粒体的功能障碍，研究人员用H2O2处理NE-4C和C2C12，构建衰老细胞模型（图5a）。H2O2处理显著抑制了两种细胞中ATP合成、CV活性和mtDNA拷贝，破坏线粒体呼吸作用，而年轻sEVs处理能显著改善H2O2诱导的衰老细胞线粒体功能障碍（图5h-k）。此外，在NE-4C和C2C12细胞中，H2O2能诱导p21表达并抑制细胞增殖，而年轻sEVs逆转了H2O2造成的不良影响，抑制细胞衰老并恢复细胞增殖能力（图5l-q）。总之，这些结果表明，年轻sEVs可以促进衰老细胞线粒体生物合成，改善线粒体功能障碍。
图S12.年轻sEVs处理改善细胞线粒体功能，抑制细胞衰老
8
据报道，sEVs的生物活性几乎没有物种特异性。于是，为了探究年轻人的sEVs是否可以改善小鼠的衰老表型，研究人员从年轻男性（19-24岁）的血浆中纯化sEVs，并用与小鼠sEVs相同的剂量和频率静脉注射到衰老小鼠体内（图S13a）。结果表明，年轻人sEVs能有效改善衰老小鼠的认知缺陷和耐力（图S13b-f），显著改善衰老小鼠海马和肌肉中线粒体功能、数量和结构（图S13g-m）。同样，琥珀酸脱氢酶（SDH）染色结果表明年轻人sEVs处理显著恢复了衰老小鼠肌肉中的线粒体活性（图S13n-o）。此外，年轻人sEVs处理能促进NE-4C和C2C12细胞的ATP合成、CV活性和mtDNA含量（图S14a-g），同时增强细胞线粒体呼吸水平（图S14h-k），抑制p21表达水平，并促进细胞增殖（图S14l-q）。总之，这些结果表明，与年轻小鼠血浆sEVs作用相似，年轻人血浆sEVs也能挽救衰老小鼠组织功能障碍和线粒体中缺陷。
图S13.年轻人血浆sEVs改善衰老小鼠衰老表型并弥补线粒体缺陷
9
从上述表型来看，目前尚不清楚年轻血浆sEVs的年轻化作用与何种成分有关。sEVs的固有结构使信息分子（包括蛋白质、脂质、DNA和RNA）能在细胞间进行有效传递。迄今为止，大量研究都是针对了解sEVs中的RNA成分，尤其是microRNA（miRNA）。事实上，包裹在sEVs中的miRNA可以转运到受体细胞中，从而对靶基因和细胞通路产生影响。于是，研究人员推测血浆sEVs中的部分miRNA可能是年轻血液中的年轻化因子。为了证实这一猜想，研究人员首先通过小RNA深度测序检测了衰老和年轻小鼠血浆中的miRNA谱，结果发现，与年轻小鼠血浆相比，衰老小鼠血浆中有75个miRNA呈现显著差异表达(其中升高32个，降低43个)（表S2）。基于血浆miRNA图谱，通过层次聚类分析能将衰老血浆样本与年轻血浆样本清楚地区分开来（图 6a）。随后，研究人员全面分析了与年龄相关的循环miRNA的现有文献，总结了它们在整个衰老过程中的变化规律，并鉴定出90个miRNA作为衰老过程的特征标志，其中53个随着年龄的增长而增加，37个随着年龄的增长而减少（表S3）。紧接着研究人员将小RNA测序结果与文献总结结果进行了比较，筛选出15个有显著差异的miRNA（在衰老小鼠血浆中含量高于年轻小鼠血浆的有7个，低于年轻小鼠血浆的有 8 个）（图 6b）。定量分析进一步证实， 在衰老小鼠与年轻小鼠血浆中有10个、老年人类与年轻人类血浆中有9个miRNA呈现显著差异表达，其中9个miRNA在小鼠血浆与人血浆中变化一致（图6c-d）。为了进一步评估与年龄相关的循环miRNA的生物学相关性，研究人员测定了衰老小鼠、年轻小鼠、老年人类和年轻人类血浆sEVs中的9个miRNA，发现miR-29a-3p、miR-29c-3p和miR-34a-5p在衰老小鼠和人类血浆sEVs中的含量显著升高，而miR-144-3p、miR-149-5p和miR-455-3p在年轻小鼠和年轻人类血浆sEVs中的含量显著升高（图6e-f）。因此，miR-144-3p、miR-149-5p和miR-455-3p被认为是年轻sEVs中的特征miRNA，而miR-29a-3p、miR-29c-3p和miR-34a-5p则是衰老sEVs中的特征miRNA。
随后，研究人员探究了年轻sEVs注射后，其包含的miRNA可否被衰老组织吸收。于是，研究人员用PKH26（一种专门用于标记sEVs脂质双层的红色荧光染料）标记年轻sEVs，然后将PKH26标记的sEVs静脉注射到衰老小鼠体内，并追踪年轻sEVs在衰老小鼠体内的分布。结果发现，只注射PKH26染料，在衰老小鼠的组织切片中无法观察到荧光积累，但注射PKH26染料标记的年轻sEVs后，在衰老小鼠的海马和肌肉中观察到明显的红色荧光（图S15），表明年轻sEVs可能通过血液转移到海马和肌肉等组织。
接下来，研究人员检测了衰老组织对sEVs中miRNA的摄取情况，即将年轻小鼠sEVs注射到衰老小鼠后，在衰老小鼠中分别测量miR-144-3p、miR-149-5p和miR-455-3p的成熟和前体形态，结果发现，在衰老小鼠的心、肝、脾、肺、肾、海马、肌肉和睾丸中成熟的miR-144-3p、miR-149-5p和miR-455-3p含量显著增加（图S16a）。然而，在这些组织中未观察到前体miRNA含量的改变（图S16b），这表明年轻sEVs无法诱导内源性miR-144-3p、miR-149-5p和miR-455-3p的水平变化。因此，衰老组织中miR-144-3p、miR-149-5p和miR-455-3p的升高可能是由于sEVs介导外源性miR-144-3p、miR-149-5p和miR-455-3p递送到相应组织。
图6.衰老过程中血浆和sEVs中miRNA含量的变化
图S15.追踪荧光标记的年轻sEVs在衰老小鼠海马和肌肉中的分布
图S16.衰老小鼠注射年轻血浆sEVs后，衰老组织对sEVs miRNA的摄取
10
接下来，研究人员预测了可能受年轻和衰老血浆sEVs中miRNAs调控的靶基因。通过文献调研，研究人员确定了衰老和年轻血浆sEVs中具有代表性的miRNA所共有的关键靶基因。如图S17a所示， PGC-1α是miR-29a-3p、miR-29c-3p和miR-34a-5p负调的常见靶标，其是线粒体生物发生和功能的主要调控因子。相反，由于miR-144-3p、miR-149-5p和miR-455-3p的下游靶基因，如β淀粉样蛋白前体蛋白（APP）、多聚（ADP-核糖）聚合酶-2（PARP-2）和低氧诱导因子1-α抑制剂（HIF1an），与PGC-1α呈负相关，因此miR-144-3p、miR-149-5p和miR-455-3p可被认为是PGC-1α表达的间接刺激物（图S17a）。可能的结合位点见图S17b。不同物种的miRNA序列和miRNA结合位点序列高度保守（图S17b-c）。
作为线粒体稳态的关键调节因子，PGC-1α通过协调核基因组和线粒体基因组编码的线粒体蛋白的表达来促进线粒体的生物发生，并通过调控线粒体质量和促进线粒体再生来维持线粒体质量和数量的稳定。PGC-1α在线粒体生物发生和OXPHOS中的重要作用引发研究人员作出假设，在年轻血浆sEVs中富集的miRNA可能通过正向调节PGC-1α对线粒体能量代谢产生有益影响，而在衰老血浆sEVs中富集的miRNA可能通过负向调节PGC-1α而加剧线粒体生物发生受损。与之相符，在NE-4C和C2C12细胞中的实验证实miR-29a-3p、miR-29c-3p和miR-34a-5p模拟物可以抑制PGC-1α的表达（图7a）。此外，miR-144-3p、miR-149-5p和miR-455-3p模拟物能直接抑制APP、PARP-2和HIF1an的表达（图7b），这反过来导致细胞中PGC-1α表达增加（图7a）。
随后，研究人员在体内外研究了PGC-1α是否与年轻sEVs促进衰老组织年轻化的作用有关。与先前的研究结果一致，PGC-1α通常在ATP需求大的组织中高表达，其表达随年龄增长而降低。与其他代谢基因相比，PGC-1α尤其容易受到衰老的影响；并且与年轻小鼠相比，衰老小鼠的海马和肌肉中PGC-1α表达显著降低（图S18a）。研究人员将来自年轻小鼠的sEVs注射到衰老小鼠体内，发现其可增加海马和肌肉中PGC-1α的表达（图7c-d），同时在NE-4C和C2C12细胞中也增加了PGC-1α的表达（图7e）。相反，将衰老sEVs注射到衰老小鼠体内，并没有改变海马和肌肉中PGC-1α的表达（图S18b）。另一方面，来自年轻人类供血者的sEVs对衰老小鼠海马和肌肉以及NE-4C和C2C12细胞中PGC-1α的表达有正面刺激作用（图S18c-e）。为了确定年轻sEVs是否通过调控PGC-1α的表达来发挥年轻化的作用，研究人员将靶向PGC-1α的小干扰RNA (siRNA)与年轻sEVs一起转染到NE-4C和C2C12细胞中，结果发现，siRNA介导的PGC-1α沉默大大降低了年轻sEVs对线粒体呼吸的有益作用（图S19）。这些发现表明，年轻sEVs的年轻化作用至少部分是由PGC-1α介导的。
为了评估sEVs中miRNA对年轻sEVs的年轻化作用是否不可或缺，研究人员用Triton X-100(能渗透sEVs的膜)和RNase(核糖核酸酶)预处理年轻sEVs，然后将所得的年轻sEVs培养NE-4C和C2C12细胞。结果发现，结构完整的年轻sEVs能够改善NE-4C和C2C12细胞的线粒体呼吸，但在用Triton X-100和RNase预孵育的年轻sEVs处理的细胞中，检测到线粒体OCR显著降低（图S20），表明年轻sEVs的作用因miRNA的降低而显著减弱。（此前的研究表明，sEVs的膜结构能够保护其RNA载体不被RNase降解；因此，Triton X-100和RNase共同处理可以快速降低sEVs中miRNA的含量。）
最后，研究人员探究了年轻sEVs中的miRNA载体是否能通过增强PGC-1α的表达来改善线粒体代谢。通过转染相应的模拟物来诱导NE-4C和C2C12细胞中miR-144-3p、miR-149-5p和miR-455-3p的表达，结果发现，可显著提高呼吸速率、ATP产量和线粒体质量（图7f-h）。为了特异性地阻断内源性miR-144-3p、miR-149-5p和miR-455-3p的功能，研究人员将miR-144-3p、miR-149-5p和 miR-455-3p的反义寡核苷酸（能特异性敲低目标miRNA含量）与年轻血浆sEVs共转到NE-4C和C2C12细胞中，并与仅用年轻sEVs处理的细胞比较来评估细胞的代谢和衰老表型（图8a）。在NE-4C和C2C12细胞中，年轻sEVs能够显著增强PGC-1α表达、增强线粒体呼吸、促进ATP合成和提高线粒体含量，而反义寡核苷酸则完全逆转了年轻sEVs在促进PGC-1α表达和线粒体能量代谢方面的有益作用（图8b-i）。同样，年轻的sEVs能有效抑制细胞衰老并激活细胞增殖，细胞中p21表达的减少和EdU结合的增加证实了这一点，而反义寡核苷酸在很大程度上抑制了年轻sEVs这些有益的作用（图8j-m）。因此，包含在年轻血浆sEVs中的miR-144-3p、miR-149-5p和miR-455-3p是起年轻化作用的关键miRNA，具有促进PGC-1α表达和改善线粒体能量代谢的潜力。
随后，研究人员探究了衰老sEVs中的miRNA是否会降低PGC-1α的表达并驱动与年龄相关的线粒体损伤。与预期相符，衰老sEVs很大程度上能抑制年轻小鼠海马和肌肉中PGC-1α的表达（图S18f）。同样，直接转染miR-29a-3p、miR-29c-3p和miR-34a-5p模拟物会导致NE-4C和C2C12细胞中PGC-1α表达降低（图7a），同时导致线粒体活性降低和mtDNA含量下降（图7f-h）。接着，研究人员将miR-29a-3p、miR-29c-3p和miR-34a-5p的反义寡核苷酸与年老血浆sEVs共转到NE-4C和C2C12细胞中，发现年老sEVs能显著抑制NE-4C和C2C12细胞中PGC-1α的表达，导致线粒体活性受损，mtDNA含量降低，细胞衰老标志物p21表达升高;然而，与反义寡核苷酸共同处理能显著挽救衰老sEVs对线粒体生物发生和代谢的有害影响，使PGC-1α表达、线粒体功能和p21水平恢复到正常状态（图S21），这进一步证明衰老sEVs的促衰老作用至少部分是通过其miRNA负载来实现的。因此，衰老血浆sEVs中的miR-29a-3p、miR-29c-3p和miR-34a-5p是促进衰老的关键miRNA，其功能与年轻血浆sEVs中miR-144-3p、miR-149-5p和miR-455-3p完全相反。
图S18.年轻和衰老sEVs调控PGC-1α在体内和体外的表达
总结
φ(≧ω≦*)♪
喜欢我们吗？点击下方“阅读原文”关注我们吧~
๑乛㉨乛๑ ↓
更多精彩内容，点击下方“往期推荐”
代谢学人 The metabolist
长按识别二维码
关注我们，精彩不断
了解更多科研知识和进展
