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撰文 | 李姿萱 郭钰涵 刘梓棋 于柳 李章燕 周文豪 邱瑾
编辑 | 孟美瑶
校对 | 于柳
背景介绍
棕色脂肪组织（BAT）主要通过解偶联蛋白1 (UCP1)以非震颤性产热的形式（NST）将能量转化为热量。研究发现，在较瘦人群与心脑血管疾病低风险人群中BAT的质量较高。米色脂肪细胞主要存在于皮下白色脂肪组织(WAT)中，白色脂肪组织能够在冷暴露或药物诱导的条件下发生棕色化（米色化）。cAMP是棕色化过程中的主要调节因子。激活与G蛋白偶联的β-肾上腺素能受体或嘌呤能受体可以促进cAMP的产生，cAMP通过激活PKA促进脂肪分解，并上调UCP1的表达从而促进产热。除此之外，cAMP还能够通过EPAC（cAMP直接活化交换蛋白，exchange protein directly activated by cAMP）传递信号。EPAC蛋白是一种鸟嘌呤核苷酸交换因子，对cAMP的亲和力与PKA接近，能够调控瘦素信号传导、胰岛素分泌和骨骼肌中AKT的磷酸化。EPAC1蛋白包含一个cAMP结合位点和一个与鸟嘌呤核苷酸交换因子GEFs同源的结构域，EPAC1结合cAMP后会激活其GEFs活性；因此EPAC1也被认为是一种GEFs，且直接被cAMP调控（Epac is a Rap1 guanine-nucleotide-exchange factor directly activated by cyclic AMP. Nature. 1998; 396, 474–477.）。而GEFs通常通过调节小G蛋白的活性来控制细胞功能。研究发现，GEFs通过催化与G蛋白结合的GDP到GTP的交换来开启信号传导。如：Ras蛋白，最典型的小G蛋白，需要释放其结合的GDP然后再结合GTP才能活化，这一过程可被GEFs催化（GEFs and GAPs: critical elements in the control of small G proteins. Cell. 2007;129(5):865-77.）。另外，EPAC蛋白缺失后可抑制瘦素的合成和分泌，使血浆瘦素水平下降，并通过上调蛋白酪氨酸磷酸酶（SHP2）促进JAK2激酶磷酸化以及下丘脑和免疫细胞中的Stat3转录因子转录，进而促进瘦素信号传导；EPAC还可作为cAMP的下游信号分子被激活，而促进β细胞分泌胰岛素；此外， EPAC1可通过激活Rap1（Ras相关蛋白1，是一种小G蛋白，属于Ras超家族。与其他G蛋白一样，Rap1与GTP结合时具有活性，而与GDP结合时无活性），使其与PI3K亚基结合并激活骨骼肌中AKT磷酸化。总的来说，EPAC1是一种催化酶，可被认为是一种需要cAMP激活的GEFs，可通过其GEFs活性功能参与细胞功能调控。
1. EPAC1促进棕色前体脂肪细胞的分化
2. EPAC1促进白色脂肪细胞棕色化
3. EPAC1可促进BAT的生长
4. PDGFRα+细胞中EPAC1的缺失导致BAT质量降低，并加重肥胖
研究结果
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附图1. 激活EPAC1促进棕色脂肪的形成
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前体脂肪细胞中EPAC1信号通路的鉴定
研究人员使用007、PKA特异性活化剂[6-MB-cAMP (6-MB)和去甲肾上腺素 (NA/NE)]处理成熟棕色脂肪细胞，并通过检测脂肪细胞中甘油的释放量来反映脂肪的分解程度，结果发现直接激活EPAC1并不会激活棕色脂肪细胞的脂解能力(附图2a)。为了探究棕色前体脂肪细胞中EPAC1-cAMP和cAMP/PKA信号通路之间的差异，研究人员对007、6-MB处理组与对照组进行了高灵敏度磷酸化蛋白质组学分析，结果显示，三组之间均存在显著差异(图1d)。mTORC1是细胞生长和合成代谢的重要调控因子，激活EPAC1后mTORC1底物(4E-BP1Ser64/Thr69、LARP1 Ser743/751和MAP1B Ser1247/1260)的表达水平提高，但在激活PKA后mTORC1底物的表达水平并没有增加(图1e)，说明EPAC1可能会影响棕色前体脂肪细胞的增殖。为了验证这一假设，研究人员对MAPK和CDK1信号分子展开研究（注：MAPK和CDK1是响应细胞外信号，调控细胞进入细胞周期的关键信号分子）。先前已有研究证明，cAMP浓度升高会抑制PKA对CDK1的Tyr15位点的磷酸化作用，从而阻断细胞周期进入m期。研究发现，激活PKA会促进棕色前体脂肪细胞中CDK1的Tyr15位点的磷酸化(附图2b)，但MAPK14 (即p38α，Ser2)只有在EPAC1激活时才能发生磷酸化(图1f)。尽管EPAC1和PKA的激活均诱导ERK1 (Thr88和Tyr90)和ERK2 (Tyr185和Thr183)的磷酸化(图1f)，但它们具有不同的ERK底物磷酸化特征(附图2c)。
研究人员用Western Blot对上述结果进行验证，结果显示，与对照组相比，007显著促进了棕色前体脂肪细胞中ERK1/2的磷酸化，而U0126（小编注：U0126是一种选择性、非竞争性MAPK激酶抑制剂，抑制MAPK通路中的MEK1和MEK2的磷酸化进而抑制其活性）处理则可阻断其对ERK1/2的磷酸化(附图2d)。与此一致的是，与WT小鼠相比，EPAC1 KO小鼠的前体脂肪细胞和BAT中ERK1/2的磷酸化水平均显著降低(图1g, 附图2e)。为了进一步分析EPAC1-和PKA依赖性的cAMP信号传导差异，研究人员检测了007、6-MB处理后棕色前体脂肪细胞中DUSP1（DUSP1可以去磷酸化ERK1/2，抑制ERK信号传导）的表达水平，结果显示，激活PKA会促进DUSP1的表达(附图2f)。与DUSP1的表达增加相符，研究人员用007或6-MB持续处理棕色前体脂肪细胞48h后，发现使用6-MB持续激活PKA会显著抑制ERK1/2的磷酸化水平，而持续激活EPAC1则仍会显著促进ERK1/2的磷酸化水平(附图2g)（小编注：在图1f中，研究人员是用007或6-MB急性刺激棕色前体脂肪细胞，6-MB是PKA特异性活化剂，结果发现ERK1/2能够被活化的PKA磷酸化，在附图2g中，研究人员是用007或6-MB持续处理48h，发现与对照组相比，ERK1/2的磷酸化水平显著降低。因此，此处作者认为“持续激活”PKA会显著抑制ERK1/2的磷酸化水平。这也在一定程度上反映了，EPAC1和PKA依赖性的cAMP信号传导之间存在差异的可能的原因）。
已知冷应激会刺激机体释放NA，促进BAT的生长，而ERK1/2在许多细胞中都能被NA激活，为了探究NA和007是否可以通过MEK/ERK途径促进棕色前体脂肪细胞的增殖，研究人员通过EdU实验发现，007和NA处理促进了棕色前体脂肪细胞的增殖，但使用U0126处理棕色前体脂肪细胞之后，反而抑制了棕色前体脂肪细胞的增殖 (图1h)，并且消除了007促进棕色前体脂肪细胞分化的效果(附图2h)，这表明MEK/ERK通路在EPAC1诱导的棕色前体脂肪细胞分化中起到至关重要的作用。此外，研究人员使用NA和EPAC抑制剂ESI-09处理细胞发现，NA诱导的ERK1/2磷酸化的能力被显著抑制（图1i），证明NA激活ERK1/2需要EPAC1的参与。
此外，ESI-09能够完全消除NA诱导棕色前体脂肪细胞增殖的效果(图1j)，同样，与WT小鼠相比，从EPAC1 KO小鼠中分离的棕色前体脂肪细胞的增殖水平显著降低(附图2i)。与此一致的是，007处理组中含有脂滴的细胞数目显著增加(附图2j)。
值得注意的是，雷帕霉素（mTOR抑制剂）也减弱了007和NA对棕色前体脂肪细胞增殖的影响，这表明ERK1/2和mTORC1都是EPAC1诱导棕色前体脂肪细胞增殖的下游通路(附图2k)。
以上数据表明，EPAC1信号介导NA诱导的棕色前体脂肪细胞的增殖。
为了进一步确定EPAC1调控前体脂肪细胞分化的时间点，研究人员在分化的不同阶段用007激活cAMP/EPAC通路，结果显示，所有处理组中含有脂滴的细胞数量均显著增加，并且Pparg和Ucp1表达水平都显著上调，但在增殖和诱导阶段使用007处理的效果最为明显(附图2l-n) （小编注：脂肪前体细胞诱导分化的过程主要分为两个阶段：第一阶段是细胞增殖长满后，接触抑制2天，该过程目的是让细胞退出生长周期；第二阶段是添加分化诱导剂诱导细胞分化成熟阶段。因此d-2到d0对应增殖到最大密度后持续接触抑制的阶段，而d0到d2对应开始添加诱导分化剂的诱导阶段）。
为了探究在分化诱导阶段使用007处理时其他相关因子的作用机制，研究人员对C/EBPβ展开研究。C/EBPβ是调控棕色前体脂肪细胞分化的关键转录因子，在诱导产热过程中起关键作用，并且在管状上皮细胞中受到EPAC1的调节。研究人员在诱导阶段用007处理棕色前体脂肪细胞发现，在WT棕色前体脂肪细胞中C/EBPβ表达水平显著增加，而在EPAC1 KO细胞中无显著变化(图1k, 附图2o)。
研究人员用表达不同CRISPR-Cas9构建体的LV（慢病毒）转染棕色脂肪细胞，并检测C/EBPβ基因的表达，最终确定了用靶向C/EBPβ的CRISPR构建体#2转染棕色脂肪细胞以敲低C/EBPβ基因的表达水平（编码C/EBPβ）(附图2p, q, r)。研究人员用007处理LV-NTC组（非靶向对照组）与CRISPR组后发现，与LV-NTC组相比，敲低C/EBPβ抑制了脂肪生成和产热基因的表达水平(附图2q,r)（小编注：敲低C/EBPβ抑制了脂肪生成和产热基因的表达水平，而给予EPAC1特异性激活剂007处理后，可部分逆转敲低C/EBPβ带来的效应，但却不能恢复到与LV-NTC组相当的水平，因此也可以说敲低C/EBPβ部分抑制了007对脂肪生成和产热的促进作用，这也初步提示007处理细胞的作用机制可能和增强C/EBPβ的转录调控作用有关）。
为了探究cAMP/ EPAC调控C/EBPβ的相关机制，研究人员对PDE4展开了研究，PDE4是调节棕色前体脂肪细胞胞浆内cAMP的一种磷酸二酯酶（小编注：PDE4是催化cAMP分解的酶之一，即PDE4会降低胞内cAMP水平。在棕色前体脂肪细胞中，PDE4是调节细胞膜cAMP 的主要PDE（Phosphodiesterase，磷酸二酯酶）。PDE抑制剂的加入可使cAMP水平增高，并促进棕色脂肪细胞分化。参考文献：Kannabiran SA, Gosejacob D, Niemann B, Nikolaev VO, Pfeifer A. Real-time monitoring of cAMP in brown adipocytes reveals differential compartmentation of β1 and β3-adrenoceptor signalling. Mol Metab. 2020;37:100986），与EPAC1信号传导有关。研究人员用咯利普兰（Rolipram，PDE4抑制剂）处理棕色前体脂肪细胞，发现咯利普兰进一步促进了007诱导的C/EBPβ表达水平的升高(附图2s)，在该实验的基础上，研究人员用U0126处理棕色前体脂肪细胞，发现阻断ERK通路后，不会影响007与咯利普兰促进C/EBPβ的表达，因此这一过程与ERK1/2通路无关(附图2t)。
图1.激活EPAC1促进棕色脂肪的形成
附图2. EPAC 1通过ERK 1/2信号转导上调棕色前体脂肪细胞中的C/EBPβ表达水平
4
EPAC1促进白色脂肪细胞棕色化
在白色前体脂肪细胞中刺激cAMP-EPAC1通路不会促进脂肪生成基因Fabp4和Pparg的表达(图1l)。与WT白色脂肪细胞相比，EPAC1 KO白色脂肪细胞的脂肪生成和分解能力也无显著差异(附图3a-c)。此外，用007处理原代白色前体脂肪细胞不会促进细胞增殖和ERK1/2的磷酸化（附图3d, e），体现了EPAC1的调控作用在棕色和白色脂肪细胞之间的差异（小编注：根据前文推测，作者检测了EPAC1在BAT和WAT中的表达情况，发现EPAC1在BAT中最高，在米色脂肪中含量居中，在白色脂肪中最少，暗示EPAC1可能主要在BAT中发挥更重要的作用；结合下文可知EPAC1在WAT中主要促进其发生棕色化）。相比之下，用007处理白色前体脂肪细胞促进了分化过程中Ucp1、Pgc1a、Cox8b和Tfam的表达，并且白色脂肪细胞的脂滴明显变小(图1m, 附图3f)，C/EBPβ表达水平增加(附图3g)。综上所述，cAMP可以通过调控EPAC1促进产热，并促进白色脂肪细胞的棕色化。
附图3. 白色前体脂肪细胞的增殖与EPAC1无关
5
EPAC1可促进BAT的生长
为了探究EPAC1信号传导在体内的作用，研究人员每天给成年小鼠注射007，持续1周，结果显示，与对照组相比，实验组小鼠的BAT质量和脂肪细胞密度均显著增加，UCP1蛋白表达水平增加，而甘油三酯含量无显著差异(图2a,b, 附图4a)，研究人员将小鼠暴露于4℃环境并检测其耗氧量，发现与对照组相比，实验组小鼠的BAT依赖的能量消耗显著增加(图2c,d)。此外，用NA处理从注射007的小鼠中分离出来的BAT之后，发现UCP1依赖性呼吸水平显著增强（图2e）（小编注：文中作者用NA处理注射了007的UCP1 WT和 KO小鼠的BAT，发现与KO组相比，WT组BAT的呼吸能力显著增加，即定义为UCP1依赖的呼吸）。
为了进一步研究EPAC1在机体内代谢的作用，研究人员将EPAC1全身敲除的小鼠暴露在寒冷条件下1周，结果发现，与WT小鼠相比，EPAC1 KO小鼠的BAT质量明显减少 (图2f)，耗氧量显著降低，BAT功能下降(图2g)， UCP1表达水平和产热基因(Cox8b、Tfam和Nd5)表达水平也显著降低(图2h, 附图4b)。接下来，研究人员每天给EPAC1 KO小鼠注射007或NaCl（vehicle），持续一周后在4℃环境下暴露1h，结果显示，007处理的EPAC1 KO小鼠的能量消耗情况(附图4c,d)和BAT的生长情况(附图4e)与NaCl组相比无显著差异，进一步确定了007是通过调控EPAC1来发挥作用的。
研究人员发现，在室温（RT, 23℃）和热中性（TN, 30℃）条件下，EPAC1在BAT中的表达水平无显著差异(附图4f)，于是研究人员将WT小鼠饲养在30℃环境，每天注射007，持续一周，发现与vehicle组（注射NaCl）的小鼠相比，注射007的小鼠的BAT质量显著增加，但耗氧量无显著差异(附图4g, h)。而EPAC1 KO小鼠的BAT质量和脂滴大小与WT小鼠接近(附图4i,j)。热中性条件下EPAC1 KO和WT小鼠的能量消耗水平、产热和炎症基因表达无显著差异(附图4k-n)。
以上结果表明，EPAC1能够促进BAT生长，当机体处于冷暴露或生理性激活状态时促进产热。
图2. EPAC1信号在小鼠体内促进BAT的生长和功能
附图4. 热中性时的EPAC 1信号传导情况
6
PDGFRα+细胞中EPAC1的缺失导致BAT质量降低
PDGFRα+细胞是产热脂肪细胞的前体细胞，由于EPAC1在前体脂肪细胞中具有重要作用，研究人员对PDGFRα+细胞展开了研究，发现BAT中PDGFRα+细胞的EPAC1表达量明显高于PDGFRα-细胞(图3a)。研究人员对冷暴露小鼠的BAT进行了单细胞测序，发现EPAC1在PDGFRα+前体脂肪细胞ASC1亚群（小编注：是脂肪干细胞亚群1，属于前体脂肪细胞的一种）中的表达量最高，该亚群对寒冷具有敏感性(附图5a-d)。
值得注意的是，冷暴露的EPAC1 KO小鼠BAT中的Pdgfra基因（前体脂肪细胞标志物）表达显著低于冷暴露的WT小鼠，这表明EPAC1的缺失抑制了PDGFRα+棕色前体细胞的增殖(图3b)。相比之下，用007激活EPAC1后，PDGFRα+细胞增殖水平明显增加(图3c)。
因此，研究人员通过在PDGFRα+细胞中选择性敲除EPAC1构建Pdgfrα-cre小鼠模型—EPAC1 PKO小鼠。研究人员将EPAC1 PKO小鼠和WT小鼠置于室温观察24h，发现二者在室温下的耗氧量无显著差异(附图6a)。随后研究人员将EPAC1 PKO小鼠和WT小鼠在4℃环境中暴露一周，发现EPAC1 PKO小鼠在冷暴露环境下的耗氧量明显低于WT小鼠(图3d)，但二者的体重没有差异(附图6b)。重要的是，与WT小鼠相比，冷暴露后的EPAC1 PKO小鼠的BAT质量和UCP1表达水平显著降低(图3e-g)。研究人员对WT和EPAC1 PKO小鼠进行了为期7天的冷暴露实验，每天连续监测小鼠的身体核心温度，结果发现，EPAC1 PKO小鼠的核心体温整体低于WT小鼠，但这种变化主要出现在冷暴露后的第4天至第7天(附图6c,d)。
此外，研究人员将EPAC1 flox/flox与UCP1 cre/+小鼠杂交获得EPAC1 UCP1 KO小鼠。冷暴露1周后，WT小鼠与EPAC1 UCP1 KO小鼠的体重、BAT质量、产热基因表达水平和耗氧量均无显著差异(图3h-l)。（小编注：上述研究结果表明，在PDGFRα+细胞中选择性敲除EPAC1会影响机体产热，而冷暴露后的EPAC1 PKO小鼠的UCP1表达水平显著降低。因此作者构建了EPAC1 UCP1 KO小鼠进行验证，排除是UCP1导致的这一结果。）
综上所述，PDGFRα+前体脂肪细胞中的EPAC1能够维持BAT的质量，并调控BAT的适应性产热。
图3. 冷暴露条件下，EPAC1 KO小鼠的BAT质量减少，BAT中PDGFRα+细胞耗氧量降低
附图5. 单细胞RNA测序数据显示EPAC1在PDGFRα+前体脂肪细胞ASC1亚群中特异性高表达
附图6. EPAC1 PKO小鼠的PDGFRα+细胞表型情况
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PDGFRα+细胞中EPAC1的缺失会加重肥胖
图4. PDGFRα+细胞中EPAC1的敲除加剧了DIO
附图7.DIO过程中PDGFRα+细胞EPAC1特异性敲除的代谢表型
8
EPAC1的激活可以改善肥胖
图5. EPAC1的激活可以改善肥胖
附图8. 在DIO期间。激活EPAC1会增加iWAT的棕色化，并缓解HFD引起的体重增加
9
EPAC1在人棕色脂肪细胞中的作用
图6. 激活EPAC1可诱导褐色脂肪细胞的增殖和分
化
附图9. 激活EPAC1诱导hiPSC-BAP增殖和分化
总结
综上所述，EPAC1是棕色脂肪细胞增殖和分化的主要调节因子，是一种可以通过药理学激活剂直接靶向、能够促进人类棕色/米色脂肪组织生长、能量消耗的潜在靶点。在BAT移植治疗手术中，体外激活iPSC衍生的人棕色/米色前体脂肪细胞中的EPAC1可能是一种增强BAT移植疗效的方法，激活EPAC1能够通过增加BAT质量和能量消耗来改善糖尿病和肥胖。
原文链接：https://doi.org/10.1038/s41556-023-01311-9
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