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校对 | 李姿萱
背景介绍
线粒体是一种具有双层膜结构的细胞器，即线粒体外膜(OMM)和线粒体内膜(IMM)，其中IMM向内突出到线粒体基质中。在线粒体基质中，线粒体基因组与蛋白质组装成DNA-蛋白质复合物，称为拟核(nucleoids)。线粒体DNA(mtDNA)编码呼吸链复合体的13个核心亚基(小编注：编码的13个蛋白亚基分别是呼吸链复合物Ⅰ的7个亚基(ND1、ND2、ND3、ND4、ND4L、ND5、ND6)，复合物Ⅲ的1个亚基(CYB)，复合物Ⅳ的3个亚基(COX1、COX2、COX3)和复合物Ⅴ的2个亚基(ATP6、ATP8))，对维持细胞代谢和正常生命活动至关重要。维持细胞稳态只需要两拷贝的核DNA(nDNA)，而需要的mtDNA数量则取决于细胞类型和细胞的需要，从数百个到数千个拷贝不等。mtDNA水平(即mtDNA拷贝数，copy number[CN])在细胞水平上受到严格调控(小编注：每个线粒体都含有10-10,000个mtDNA。线粒体疾病会导致mtDNA拷贝数减少，但关于这部分的分子机制目前研究比较少。参考文献：Fontana GA, Gahlon HL. Nucleic Acids Res. 2020)，但目前对mtDNA的具体调控机制仍不明确。并且，与nDNA不同的是，mtDNA能够持续复制，而不依赖于细胞周期(称为松弛型复制)，在先前的研究中，mtDNA的复制机制已被详细阐明，但对mtDNA的降解机制仍不明确。
线粒体通过不断分裂和融合事件，形成了一个动态平衡，这种平衡不仅有助于维持线粒体功能，也与细胞代谢状态相适应以响应细胞的需求。线粒体动力学的调控是维持mtDNA的水平和线粒体的质量控制的关键。在线粒体分裂事件中，受损的线粒体区域会从原线粒体上分裂下来，形成更小的线粒体，进而通过细胞自噬降解。根据损伤来源和严重程度不同，分裂出的小线粒体也有可能与其他健康的线粒体融合，以减轻自身的功能障碍；然而，如果线粒体发生了超出阈值且不可逆的损伤，则无法参与该途径。目前，虽然有研究证明受损的线粒体区域以外周分裂的方式进行分裂(小编注：作者在此引用了2021年Suliana Manley团队的一篇Nature，证明线粒体有两种分裂方式，即外周分裂(分裂点距离线粒体边缘25%以内)和中央分裂(分裂点位于线粒体中间)，外周分裂主要发生在功能失调的线粒体，产生0-3μm的小线粒体，通常不含mtDNA和mtRNA，与溶酶体接触后被降解，表明线粒体在细胞逆境胁迫的不利环境下通过外周分裂，从而及时止损。而中央分裂产生的小线粒体含有mtDNA和mtRNA，可继续进行分裂和融合，与线粒体增殖相关)，但是否有专门的IMM质量控制机制以及经过外周分裂后，分裂下来的IMM亚结构域如何与健康的线粒体融合或被降解目前尚不清楚。
线粒体分裂蛋白1(MTFP1)是一种作用于动力相关蛋白1(DRP1)上游的线粒体内膜蛋白(小编注：MTFP1能增强DRP1的表达促进线粒体分裂，此外，参考文献指出，MTFP1也能增强Fis的表达从而促进分裂。参考文献：Tondera D, Czauderna F, et al. J Cell Sci. 2005)，能够将分裂过程与多种决定细胞命运的关键通路相耦合(小编注：例如，①MTFP1表达能被PI3K通路激活，PI3-K信号转导通常被认为以抗凋亡方式起作用。②抑制MTFP1表达能促进线粒体释放细胞色素c，导致细胞凋亡。参考文献：Tondera D, Santel A, et al. J Biol Chem. 2004)，如哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1(mTORC1)的激活、细胞死亡、癌症进展以及线粒体生物能学。然而，MTFP1调节线粒体形态的机制仍不清楚。在本研究中，研究人员证明了MTFP1能够通过抑制线粒体内膜融合、协调线粒体外膜(OMM)分裂，来促进外周分裂。值得注意的是，MTFP1介导的融合抑制确保了受损的IMM亚结构域的分离与自噬性降解，细胞利用这样一个质量控制过程来降解线粒体拟核，使mtDNA维持在正常生理水平。
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mtDNA的复制机制
线粒体拥有自身的呈环状的双链DNA分子，其复制和转录受到线粒体和核基因的双重调控。参与mtDNA复制、转录、翻译的蛋白质主要来源于核基因组；例如，线粒体DNA复制需要的DNA聚合酶是由核DNA编码并在细胞质核糖体上合成的。如拓展阅读图1所示，人mtDNA是一个16569bp的环状基因组，包含37个基因，编码13种参与氧化磷酸化的蛋白质、Humanin微肽、22个tRNA和2个rRNA。被称为D环的非编码区包含重链(H链)复制起点(OriH)、转录因子结合位点和保守序列。而轻链(L链)的复制起点(OriL)位于 mtDNA 周长的2/3左右。
目前，最被大家所认可的mtDNA复制模型是链-置换模型（SDM）。在SDM模型中，mtDNA复制从OriH开始。线粒体RNA聚合酶POLRMT合成一个短RNA序列，该序列引发由DNAPolγ催化的后续复制。Twinkle解旋酶在DNA Polγ前面发挥作用，以ATP依赖性方式解开DNA。暴露的单链H链与线粒体单链DNA结合蛋白(mtSSB)结合，以防止虚假复制事件。一旦复制体到达OriL，就形成单链茎环结构，阻断mtSSB结合，促进L链复制的启动。茎环被POLRMT识别，POLRMT在OriL区域合成短RNA引物。DNAPolγ取代了POLRMT，两条链的复制单向连续进行，最终形成两个完整的双链mtDNA分子（拓展阅读图2）。
拓展阅读图1. 人类 mtDNA 的示意图
拓展阅读图2. 人类线粒体复制的链-置换模型
参考文献：
[2] Fontana GA, Gahlon HL. Nucleic Acids Res. 2020
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线粒体蛋白质量控制体系
线粒体蛋白稳态的维持对细胞功能至关重要。线粒体蛋白稳态的扰动能导致大量的细胞应激，并最终导致细胞死亡。因此，不同的质量控制机制监测线粒体蛋白质组。
首先，胞质蛋白质量控制机制确保只有正确合成的多肽才能被运送到线粒体，并且它们保持在具有运输能力的未折叠状态。其次，泛素-蛋白酶体系统(UPS)通过去除无法正确导入的多肽来控制蛋白质在线粒体外膜上的运输，并从线粒体中降解受损和错误定位的蛋白质种类。第三，线粒体基质的分子伴侣确保了核编码和线粒体编码蛋白质的正确折叠，并促进了错误折叠或聚集的蛋白质的降解。第四，许多线粒体内蛋白酶，例如与内膜和基质的各种细胞活动相关的ATP酶蛋白酶(AAA蛋白酶)，控制线粒体蛋白的转运以调节其功能并降解受损的蛋白质。两种AAA蛋白酶i-AAA和m-AAA在内膜蛋白质组的监测中起着核心作用。i-AAA将其催化中心暴露在膜间空间中，而m-AAA则面向基质。两种蛋白酶都包含一个AAA结构域，可将底物输送到其蛋白水解中心。它们的主要作用是降解错误折叠或未组装的蛋白质，包括呼吸链亚基。第五，线粒体可以通过线粒体的选择性自噬去除。
参考文献：
[2] Li Y, Xue Y, et al. EMBO J. 2019
1.MTFP本身不是促分裂因子，而是抑制IMM融合的因子
2.MTFP1能够降低线粒体外周IMM的融合能力
3.外周分裂下来的IMM子域被自噬降解
4.这种IMM质量控制机制维持了足够的mtDNA水平
研究结果
1
为了探究MTFP1如何调节膜的重塑，研究人员敲低了U2OS细胞中的DRP1或MTFP1，并进行了线粒体形态学分析。结果发现，与对照相比，敲低DRP1后，细胞中出现了少量形态拉长的线粒体，相比之下，敲低MTFP1后，细胞中出现了较多相互连接的线粒体网络，并且都伴有线粒体过度分支的现象(图1A-D)。类似地，研究人员在U2OS细胞中利用CRISPR/Cas9技术，获得了MTFP1的两个敲除克隆体(KO1和KO2)并对其进行形态学分析后，发现二者的线粒体也呈现过度分支的现象(图S1A-S1D)。接下来，研究人员通过透射电子显微镜(TEM)观察到，MTFP1 KO的细胞中线粒体形态延长且相互连接(图S1E和S1F)。最后，研究人员将MTFP1在MTFP1 KO的U2OS细胞中稳定再表达，发现线粒体形态恢复到与对照组相似的水平，从而证明了该表型的特异性(图S1G-S1I)。研究人员使用超分辨率(SR)晶格结构光显微镜活细胞成像技术，在野生型(WT)和MTFP1基因敲除(MTFP1-KO)细胞中测量了线粒体分裂速率(图1E)（小编注：StayGold是一种从水母中克隆出的荧光蛋白，这种蛋白表现出更强的亮度和极强的抗光漂白性，荧光实验中常用的EGFP蛋白荧光半衰期低于500秒，但StayGold的半衰期则大于10000秒。此外，StayGold的一个局限性是它容易形成天然的同源二聚体，因而可能在实验中产生伪影。目前在融合蛋白中大部分使用串联的StayGold标签，这一标签的尺寸接近50kDa），结果发现，在MTFP1-KO细胞中，线粒体的中央分裂不受影响，但外周分裂的速率显著降低(图1F和1G)，说明尽管MTFP1不是驱动线粒体分裂所必需的，但它可能是线粒体外周分裂中亚结构域的断裂所必需的。与此一致的是，MTFP1-KO细胞中小圆形线粒体的数量也显著减少(图1H和S1J)，过表达MTFP1则会使小圆形线粒体数量增加(图1I)，这表明MTFP1能够促进外周分裂。接着，研究人员将敲低MTFP细胞的线粒体表型与敲低Fis1或MFF的细胞中的线粒体表型进行对比(小编注：Fis1和MFF是DRP1的受体，线粒体的中央分裂和外周分裂均由DRP1介导，MFF主要调控中央分裂，而外周分裂则由溶酶体和Fis1介导)，发现敲低MFF和Fis1后的线粒体网络只表现出一定程度的融合(图1J-1L)。而与MFF和FIS1敲低相比，敲低MTFP1的细胞中相互连接的线粒体数量明显更高，这表明抑制线粒体的中间或外周分裂无法解释MTFP1缺失导致的过度分支的表型。最后，共聚焦分析显示，在用应激源处理或人为促进DRP1募集到线粒体(由MFF或线粒体锚定蛋白连接酶[MAPL]过表达触发)的情况下，MTFP1-KO线粒体的片段化与WT细胞相似(图S2A-S2D)，这表明MTFP1不是线粒体分裂所必需的。
接着，研究人员分析了线粒体融合的动态过程，该过程通过两种不同的模式进行：完全融合和瞬时融合。完全融合会形成单一且稳定的线粒体，瞬时融合迅速发生，随后在同一区域发生DRP1驱动的分裂事件(图1M)。与WT细胞相比，MTFP1-KO细胞中的线粒体融合事件的持续时间更长，线粒体融合更加稳定(图S1K)，从而导致线粒体完全融合的比例增加、瞬时融合的比例降低(图1N和1O)。此外，使用靶向线粒体基质的光激活GFP探针([OCT]-PA-GFP)处理细胞，并用特定激发光激发细胞中的一定范围的绿色荧光，随着时间的推移，与WT细胞相比，MTFP1 KO细胞中绿色荧光范围增大，进一步证实了敲除MTFP1会使线粒体融合能力增强(图1P-1R)。研究人员又在WT和MTFP1-KO细胞中敲低了MFN2(促融合因子线粒体融合蛋白2)或OPA1(视神经萎缩蛋白1)，结果发现敲低MFN2和OPA1均能挽救MTFP1缺失导致的线粒体过度分支(图S2E-S2I)。接下来，研究人员在DRP1-KO细胞中敲低了MFN2和OPA1，没有得到类似的结果(图S2J-S2L)。并且在DRP1-KO细胞中，敲低MTFP1使线粒体转变为更紧密的网络(图S3A-S3C)，表明MTFP1介导的线粒体过度分支与DRP1无关。放线菌酮(CHX)可诱导线粒体分支，导致应激后的线粒体发生过度融合。研究人员用CHX处理WT和MTFP1-KO细胞，二者均发生了线粒体的过度分支，且在MTFP1-KO细胞的分支更多(图S3D和S3E)。此外，CHX处理诱导了DRP1-KO细胞线粒体的过度分支，但在过表达MTFP1的DRP1-KO细胞中没有观察到该现象(图S3F和S3G)，进一步证实了MTFP1在抑制线粒体融合中的作用。
综上所述，由MTFP1缺失引起的线粒体分支和相互连接的增加与线粒体融合增加有关，表明MTFP1是一种抑制线粒体融合的IMM蛋白。
拓展阅读
线粒体融合/分裂相关蛋白的功能
线粒体处于动态平衡之中，在融合的过程中，MFN蛋白可以介导两个线粒体的外膜融合，而OPA蛋白则进一步介导线粒体内膜的融合，两个线粒体融合之后形成长的线粒体。在线粒体分裂的过程中，Drp1蛋白可以与线粒体上的各种与分裂相关的蛋白结合，进而介导线粒体的分裂，其中Drp1的616位丝氨酸磷酸化可以增强Drp1的活性，线粒体上与分裂有关的蛋白的有Fis1，MFF，MiD49和MiD51，其中研究得多的主要是Fis1和MFF。Drp1与这四种蛋白结合之后，进而催动线粒体分裂成更小的线粒体。
参考文献：
图1. MTFP的缺失使线粒体融合增加并导致线粒体的过度分支
附图1. MTFP1-KO细胞的线粒体分支增加
附图2. 抑制融合能够挽救MTFP1缺乏导致的线粒体过度分支
附图3. 过度分支的表型与融合增加有关
2
为了探究MTFP1如何同时调控线粒体融合和外周分裂，研究人员对WT和MTFP1 KO细胞的线粒体分裂和融合相关蛋白进行WB分析，发现与WT细胞相比，MTFP1 KO细胞中的FIS1蛋白水平较低，短型OPA1(S-OPA1)异构体水平较高(图S3H)。值得注意的是，敲低MTFP1后，FIS1蛋白水平保持不变(图1K)，这表明FIS1的下调需要MTFP1的永久缺失。有趣的是，研究人员对WT和MTFP1 KO细胞进行亚细胞分离，并将DRP1与线粒体共定位发现，虽然MTFP1 KO细胞中的总DRP1水平增加(图S3H)，但DRP1向线粒体的募集显著减少(图S3I-S3K)。鉴于MTFP1在调控线粒体融合和募集DRP1方面具有双重作用，研究人员推测MTFP1可能影响线粒体融合的稳定性。
为证实上述推测，研究人员研究了MTFP1如何控制IMM重塑。MTFP1的过表达导致线粒体发生碎片化(图S4A-S4C)，除了长型-OPA1水平降低之外(图S4D)，不影响其他不同分裂和融合因子的蛋白水平。MFN2与MTFP1共表达消除了MTFP1诱导的线粒体分裂(图S4E和S4F)，这证实了促进线粒体融合和MTFP1过表达相互拮抗。研究人员使用SR SIM分析了MTFP1过表达细胞中MTFP1的分布，结果显示该蛋白在亚线粒体水平上的定位不均匀。虽然MTFP1均匀分布在片段化的小线粒体中，但MTFP1会特定在线粒体边缘重新分布，勾勒出IMM亚结构域，并在线粒体中心区域积聚，描绘出“隔膜样”结构(图2A)。线粒体“隔膜”被描述为IMM融合中间体，并且当IMM融合受到抑制时会积累。研究人员也在隔膜处检测到了微弱的TOMM20染色，这表明之前发生了线粒体外膜(OMM)融合(图2A)。透射电子显微镜(TEM)分析显示，MTFP1过表达会导致在线粒体边缘形成隔膜和IMM亚结构域(图2B)。并且，在DRP1敲除(KO)的细胞中过表达MTFP1也诱导了IMM亚结构域和隔膜的形成，但没有导致线粒体的碎片化(图S4G-S4I)。这些结果表明，尽管MTFP1诱导的IMM融合抑制和膜的重塑与DRP1无关，线粒体外周分裂仍需要OMM分裂机制。活细胞成像证明，随时间推移，MTFP1一直定位于在隔膜样结构和线粒体-线粒体接触位点(即两个相对的线粒体保持紧密接触但不发生完全融合的位点)(图2C)。同时，虽然一些富集MTFP1的区域发生了外周分裂，形成了小线粒体，但大多数MTFP1亚结构域在线粒体外周保持稳定(图2C和2D)。值得注意的是，无论是富含MTFP1的亚结构域还是富含MTFP1的小线粒体，都没有发生线粒体的融合(图2D、E)。总体而言，这些数据表明MTFP1本身并不驱动不对称膜分裂，而是分离IMM亚结构域并防止IMM亚结构域与线粒体网络的其他部分融合，从而标记这些区域以进行外周分裂。
为了研究MTFP1如何抑制线粒体融合，研究人员从富集的线粒体组分中下拉MTFP1，进行液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)分析，发现与MTFP1存在相互作用的组分包括MFN1、MFN2、OPA1以及一些线粒体接触位点和嵴组织系统(MICOS)（小编注：MICOS（线粒体连接位点和嵴形成系统）复合体是调控线粒体嵴结构和功能的主要蛋白，其定位于嵴连接处，由2个亚复合体组成：MIC10-MIC26-MIC27亚复合体和MIC60-MIC19-MIC25亚复合体。前者主要负责嵴的形成并稳定嵴连接结构；后者主要负责在线粒体内外膜之间形成连接位点，并维持嵴连接结构，以保证线粒体结构的完整性。MIC19是位于膜间隙的可溶性膜蛋白，其结构中含有二硫键，以还原形式或氧化形式存在，主要是这几个亚基）的成分(图2F和S4J)。免疫沉淀实验证实了MTFP1与融合机制之间存在关联(图2G)。然而，BN-PAGE分析显示，MTFP1与OPA1、MFN2以及MIC60之间的电泳条带分布不均(图2H和2I)，这表明MTFP1并未与融合蛋白或MICOS蛋白形成稳定的复合物（小编注：2D BN-PAGE分析中，蛋白质或蛋白质复合物样品在自然条件下在1D BN-PAGE中分离，考马斯亮蓝染料带有负电荷，与所有蛋白质非特异性结合。考马斯亮蓝不作为洗涤剂使用，从而保留了蛋白质复合物的结构。通过BN-PAGE分离后，蛋白质和蛋白质复合物样品2D SDS-PAGE凝胶电泳分离。BN-PAGE和SDS-PAGE的结合，因为一维中的梯度凝胶和二维中的线性凝胶，单体蛋白质将以双曲线对角线迁移，而蛋白质复合物的组成成分位于该对角线以下。代表同一蛋白质复合物亚基的蛋白质可以在二维的一条垂直线中找到，而同一蛋白质在水平线中的多个斑点表明该蛋白质同时存在于几种不同的蛋白质复合物中，图中四种蛋白电泳条带不均，说明不在同一个蛋白质复合物中）。这些数据表明，尽管MTFP1可能与这些蛋白紧密接触，但它们之间的相互作用可能是间接的或瞬时的。最近的人类OPA1结构模型显示，L-OPA1定位在IMM的融合位点，而S-OPA1在MTFP1-KO细胞中水平增加(图S3H)，S-OPA1在线粒体融合过程中以心磷脂(CL)依赖的方式发生寡聚化，以介导膜重塑（小编注：OPA1可通过脂质结合桨结构域将自身嵌入含心磷脂的膜中。桨状结构域内的保守环深深插入线粒体双层膜中，进一步稳定与富含心磷脂的膜的相互作用。通过桨结构域的OPA 1二聚化驱动细胞中的线粒体融合。参考文献：von der Malsburg A, Sapp GM, Zuccaro KE, et al. Nature. 2023）。接下来，研究人员利用LC-MS分析了敲低MTFP1的U2OS细胞中线粒体的心磷脂水平，发现MTFP1的敲低并未导致线粒体CL含量或特定CL种类的差异(图S4K)。然后，研究人员使用荧光染料10-N-壬基吖啶橙(NAO)(小编注：该染料可以与线粒体阴离子磷脂，特别是线粒体CL结合)对WT和MTFP1-KO细胞进行染色，观察到WT细胞的染色较为均匀，而MTFP1-KO细胞中则表现出异常的CL分布，出现了CL富集的区域(图2J)。（小编注：心磷脂（CL）是含有3-4个脂肪酰基侧链的独特磷脂。在真核生物中，它主要分布在线粒体内膜，占线粒体内膜磷脂总量的10-25%。心磷脂独特的锥状结构能稳定线粒体膜结构，有文献证明，膜形态是由线粒体接触位点和嵴组织系统（MICOS）、F1Fo ATP合酶、融合蛋白OPA1/Mgm1、磷脂心磷脂和磷脂酰乙醇胺产生和维持的。这些蛋白质复合物和磷脂嵌入一个功能相互作用的网络中，并动态重塑线粒体内膜。有研究表明，OPA1能够通过与反式心磷脂特异性结合来进促进异质性膜的融合，并且CL会增强GTP水解活性，OPA1有两种运作模式，如下图所示：1.“融合模式”：在OM融合后，切面IM立即融合，因为IM接触点会伴随着较高的CL值富集，从而介导OPA1依赖性融合（左图）。2. "嵴模式"：无OM的IM融合时，CL富集较少，可通过OPA1 相互作用形成嵴（右图）。
参考文献：
[1] Ban T, Ishihara T, Kohno H, et al. Nat Cell Biol. 2017
[2] Colina-Tenorio L, Horten P, Pfanner N, Rampelt H. J Intern Med. 2020
最后，免疫印迹分析显示，与WT细胞相比，MTFP1-KO细胞的OPA1寡聚体形成增加，OPA1寡聚化能力更强，而MTFP1的过表达则导致OPA1寡聚体组装水平的降低(图2K和2L)。因此，研究人员认为MTFP1通过建立一个不利于融合的脂质环境来抑制线粒体融合，从而影响OPA1的寡聚化及其随后的IMM融合。
图2. MTFP1位于线粒体边缘，抑制IMM融合
附图3. 过度分支的表型与融合增加有关
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先前有研究表明，线粒体DNA拷贝数(mtDNA CN，即mtDNA水平)与线粒体的动态平衡相关。通过流式细胞荧光分选技术(FACS)和单细胞数字液滴(dd)PCR分析发现（小编注：ddPCR (Droplet digtial PCR)又称微滴式数字PCR，是一种使用微流控或微孔板与油相，将PCR反应体系分成油包水液滴单独进行PCR扩增的技术，通过ddPCR技术分别对内参基因与外源基因拷贝数进行绝对定量，该ddPCR方法包括四个步骤：1.液滴生成：通过液滴生成技术将样品分成约20000个油包水的液滴，每个液滴代表一个独立的PCR系统。每个微液滴内包含有一个DNA模板分子或不含模板DNA分子(实际情况也会存在一个液滴中有２个或多个核酸分子，因此核酸分子在液滴中的分布符合泊松分布的规律)。2.PCR扩增反应：DNA 模板分别在各自的微液滴中进行 PCR 循环扩增。3. 液滴读取：当扩增过程完成后，再对各个液滴依次进行荧光强度检测，其中检测到荧光信号的微液滴被判作 "1"，而无荧光信号的微液滴则被判作 "0"。以得到原始样品中阳性液滴的比例。4. 数据分析：统计出阳性微液滴的个数与其在总液滴中所占的百分比，使用泊松统计分析计算原始样本中存在的mtDNA拷贝数），MTFP1过表达导致mtDNA拷贝数降低(图3A)。另一方面，MTFP1敲低或敲除(图3B和3C)会导致mtDNA拷贝数显著增加，稳定再表达MTFP1后下降到与WT细胞相似水平(图3D)。相反，DRP1敲除会导致mtDNA拷贝数显著减少(图S5A)，进一步证实了线粒体分裂的减少并不是导致过度分支和mtDNA拷贝数增加的主要原因。并且MTFP1敲除能够缓解由OPA1敲低引起的mtDNA拷贝数减少，进一步支持了二者在调节IMM融合和mtDNA水平中的相互拮抗的作用(图3E)。以上数据表明，MTFP1能够调控mtDNA水平。
图3. MTFP1调控mtDNA拷贝数和拟核丰度
附图5. 抑制MTFP1可以减少与较高的线粒体突变量相关的形态与生化方面的缺陷
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通过抑制MTFP1来增加mtDNA水平可以改善异质性模型中的线粒体形态和生化缺陷
异质性是指在单个细胞或个体内存在一种以上的mtDNA类型(野生型和突变型)的现象。当突变型mtDNA的比例超过某一水平(生化阈值)时，线粒体功能会出现缺陷，从而导致线粒体疾病。为了探究在异质性背景下MTFP1诱导的IMM重塑和mtDNA拷贝数的变化，研究人员使用了一种源自患者细胞的杂交细胞系，该细胞系携带有7kb的致病性缺失(ΔH2.1)，能够影响不同氧化磷酸化(OXPHOS)基因（小编注：ΔDH2.1 细胞系为部分线粒体基因片段缺失7.5kb线粒体DNA的成纤维细胞系，同时含有完整DNA的正常线粒体；因此该细胞系具有线粒体异质性。研究人员进一步构建了ΔH2.1杂交克隆细胞，即聚乙二醇将这些细胞彼此融合。对融合产物进行选择。通过克隆环法分离单个杂交克隆，从而挑选出了不同mtDNA异质性的细胞。参考文献：Diaz F, et al. Nucleic Acids Res. 2002）。首先，研究人员通过细胞杂交构建了具有不同异质性水平的ΔH2.1杂交克隆细胞(图S5B)，分析了MTFP1缺失对具有高或低异质性克隆细胞中的mtDNA拷贝数的影响(图S5C)，发现无论在高异质性克隆还是在低异质性克隆中，MTFP1的敲低均显著增加了mtDNA拷贝数(图S5D-S5F)。此外，在高异质性克隆细胞中，线粒体碎片化显著增加，敲低MTFP1能够使线粒体碎片化减少，并促进低异质性和高异质性克隆细胞的线粒体分支(图S5G-S5I)。
近期有研究表明，增加mtDNA的水平可以改善线粒体疾病。为了研究能否通过抑制MTFP1来增加mtDNA水平从而改善ΔH2.1杂交克隆细胞的表型，研究人员在低异质性克隆和高异质性克隆细胞中敲低了MTFP1，发现敲低MTFP1不但能够部分恢复MTCO2(细胞色素c氧化酶II)和ATP8的水平(图S5J和S5K)，还改善了在高异质性克隆中观察到的线粒体呼吸缺陷(图S5L)。以上数据表明，促进IMM的融合来增加mtDNA的水平能够有效改善携带异质性致病性mtDNA突变细胞的表型。
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拟核周转需要MTFP1
为了探究MTFP1调节mtDNA拷贝数的分子机制，研究人员在WT和MTFP1-KO细胞中将线粒体DNA和正在复制的DNA进行共定位（小编注：作者使用了Tom20对线粒体进行染色，使用单克隆DNA抗体对总mtDNA进行免疫荧光染色，使用EDU试剂盒对正在复制的mtDNA进行免疫荧光染色，并将三者merge在一起；同时merge在一起的为正在复制DNA），结果发现，敲除MTFP1后，mtDNA总数和处于复制状态的mtDNA数量均显著增加，但复制状态的mtDNA与总mtDNA的比值没有变化(图3F-3I)。这一结果表明，MTFP1的缺失不会增强mtDNA的复制能力，但可能导致mtDNA的清除效率降低，进而导致拟核的积累。研究人员利用超分辨率结构光照明显微镜(SR SIM)分析发现，在MTFP1-KO的细胞中，含有mtDNA的拟核数量增加，但大小未发生显著变化(图3J和3K)。随后，研究人员监测了具有不同功能和线粒体定位的多个线粒体蛋白的表达水平。免疫印迹分析显示，在MTFP1敲除细胞中，观察到拟核的核心成分如SSBP、TFAM和Twinkle的积累(图3L)。此外，研究人员还检测到部分IMM蛋白水平升高，包括PHB2和线粒体呼吸链亚基(图3L)，先前有研究表明，这些蛋白位于mtDNA附近，因此，MTFP1可能参与含有mtDNA的IMM亚结构域的降解。
为了探究mtDNA的降解和受损拟核的清除是否都需要MTFP1，研究人员用DNA嵌入剂溴化乙锭(EB)处理了WT和MTFP1-KO细胞(小编注：溴化乙锭能够通过破坏mtDNA结构，从而促进拟核的清除)，结果显示，未用EB处理时，与WT细胞相比，MTFP1-KO细胞的mtDNA水平显著增加，用EB处理后，MTFP1 KO细胞的mtDNA水平仍显著高于WT细胞，即MTFP1 KO对EB诱导的拟核降解表现出部分抗性(图3M-3O)，这证明了MTFP1能够促进mtDNA的清除。
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MTFP1促进IMM亚结构域靶向自噬结构
为了探究MTFP1调控mtDNA拟核周转的机制，研究人员用氯喹(CQ)处理WT U2OS细胞和过表达MTFP1的U2OS细胞(氯喹可以抑制溶酶体功能)，发现用氯喹处理能够消除MTFP1过表达引起的mtDNA拷贝数(CN)减少，这表明MTFP1能够促进溶酶体依赖性的mtDNA清除(图S6A)。研究人员猜测MTFP1诱导的融合抑制可能与线粒体外周分裂过程中，形成的无法融合的小线粒体有关，于是对线粒体进行了膜电位染色(小编注：TMRE是一种线粒体特异性的具有红橙色荧光的阳离子染料，具有膜通透性，会在带负电荷的线粒体膜中迅速积累。线粒体的膜电位越高，TMRE的积累量越多，荧光值越高，因此可以通过检测TMRE荧光值的强度来定量地评估线粒体膜电位。MitoTracker是染有功能的线粒体的，探针与线粒体硫醇形成共价键，线粒体膜电位越高则Mitotracker染色越深，但Mitotracker不能动态表征线粒体功能，即使后续线粒体功能丧失，Mitotracker荧光也不会消失，这种情况下做免疫荧光固定后荧光仍在，而TMRE可以动态监测线粒体膜电位变化，只可积聚在活性线粒体中，膜电位消失之后荧光也会消失，本文TMRE和Mitotracker无Merge说明该分裂出去的小线粒体在染色之后发生了自噬，膜电位消失，TMRE荧光消失，而Mitotracker荧光不变。MitoSOX试剂是活细胞中的一种特异性靶向线粒体的新型荧光染料。MitoSOX红色试剂被超氧化物氧化，并产生红色荧光)，发现MTFP1过表达的细胞中膜电位降低，活性氧(ROS)水平升高(图S6B和S6C)。此外，研究人员用Mito-Keima荧光标记线粒体(小编注：Mito-Keima通过线粒体的色素c氧化酶亚基VIII(COX VIII)的靶向序列在线粒体上特异性表达。mito-Keima可以指示线粒体是否已进入溶酶体)，结果显示，与WT细胞相比，MTFP1-KO细胞中线粒溶酶体(mitolysosome)数量显著减少(图S6D和S6E)，这表明MTFP1缺失可能会减缓线粒体组分的更新。
研究人员利用超分辨率结构光照明(SR SIM)显微镜分析显示，过表达MTFP1不仅促进了MTFP1在线粒体外周的积累，还促进了与线粒体紧密接触或存在于细胞质中的MTFP1富集的亚结构域形成，这些亚结构域缺乏线粒体外膜标记物TOMM20，但可能含有mtDNA(图4A)。在细胞凋亡过程中，BAX和BAK被激活，在线粒体外膜(OMM)处寡聚化，在OMM处形成极大的孔，以及自噬过程中OMM蛋白(包括TOMM20)的蛋白酶体降解导致的OMM不稳定，都会导致IMM向OMM突出，从而介导mtDNA的释放（小编注：细胞凋亡过程中，BAX和BAK被激活；这导致它们在线粒体外膜 (OMM) 处寡聚化，在OMM内产生脂质孔，导致可溶性膜间空间蛋白（例如细胞色素c）从膜间空间释放；随着时间的推移，BAX/BAK介导的孔隙扩大，形成大孔，这使得线粒体外膜（IMM）能够向OMM突出并破裂，从而释放线粒体DNA (mtDNA)。参考文献：Zhang P, Yan X, Zhang X, et al. Circ Res.2023）。研究人员首先评估了BAX/BAK是否在这一途径中起作用，但在具有MTFP1过表达的部位(图S6F)及其寡聚体中并未检测到活化的BAX(图S6G)。然而，MTFP1过表达会导致TOMM20蛋白水平(图S6H)和荧光强度(图4B)降低。研究人员对MTFP1过表达的细胞进行了OMM和泛素染色共定位发现，TOMM20荧光强度较低的部位泛素水平较高，这说明TOMM20在完全消失之前发生了OMM或IMM的泛素化步骤(图S6I)。最后，研究人员用两种不同的蛋白酶体抑制剂环氧霉素(Epoxomicin)或MG132处理后，细胞中MTFP1表达量高但TOMM20荧光强度低的线粒体(即MTFP1(+)/TOMM20(-)的线粒体)显著减少(图4C)，进一步表明OMM蛋白的周转需要蛋白酶体以及IMM亚结构域的降解，研究人员将这些MTFP1(+)/TOMM20(-)线粒体称为富含MTFP1的小线粒体(SMEM)。
为了探究SMEM的降解途径，研究人员研究了SMEM与不同的溶酶体和自噬标记物的定位。首先，研究人员观察到SMEM均能与由LAMP1标记的降解性溶酶体结构(图4D和4G)、LC3B和p62标记的自噬体结构共定位(图4E、4F和S6J)。氯喹(CQ)处理后增加了自噬体中的SMEM水平(图4H和4I)，这表明这些特殊的IMM亚结构域在进入溶酶体之前，先被靶向到自噬体中。但是在DRP1-KO细胞中过表达MTFP1未能触发SMEM向溶酶体的转运(图S6K和S6L)，这表明要想实现有效的自噬降解，需要IMM融合抑制与OMM分裂机制偶联发挥作用（小编注：OMM的分裂涉及动力相关蛋白1(DRP1)的募集和组装，此过程需要特定的分子伴侣和调节因子辅助。DRP1被钙调神经磷酸酶去磷酸化并被招募到线粒体表面，随后诱导GTP水解促进膜收缩。多聚肌动蛋白通过肌动蛋白成核蛋白2(INF2)和变形蛋白结合蛋白stire1C介导，聚合在内质网和线粒体的交界处，驱动线粒体的收缩。IMM的分裂不依赖特定的分裂机制，而是通过调节融合实现间接分裂，当IMM的融合受到抑制，线粒体网络就无法进一步融合，导致线粒体在物理上被隔离成为更小的单位。参考文献：Giacomello M, Pyakurel A, Glytsou C, et al. Nat Rev Mol Cell Biol. 2020）。
近期有研究证明，某些IMM组分可作为LC3受体。研究人员通过序列分析，在MTFP1中发现了三个可能的LC3相互作用区域(LIR)，即[W/F/Y]xx[L/I/V](图S6M)。事实上，研究人员检测到了MTFP1与LC3B-II之间存在相互作用，但没有检测到与LC3B-I存在相互作用(图4J)，而在MTFP1-LIR突变体(mLIR)中，这种相互作用被部分破坏，在MTFP1mLIRx3突变体中则完全消失(图4K)。有趣的是，MTFP1mLIRx3仍然能够诱导线粒体碎片化(图4L和4M)。尽管在MTFP1mLIRx3过表达细胞中，转运至自噬体的SMEM的数量和百分比均显著减少，但仍有一定比例的SMEM被靶向到LC3阳性膜上(图4N-4P)，这表明SMEM在一定程度上可以不依赖于MTFP1-LC3B的相互作用而被降解。
总之，MTFP1能够在线粒体质量控制过程中通过两步机制实现双重功能：首先，MTFP1诱导的融合抑制与DRP1协同作用，使外周IMM亚结构域选择性分离成小的线粒体，由于这些小线粒体无法融合，这些线粒体的积累会导致不可逆的损伤，促进了它们的自噬清除。最后，MTFP1和LC3B之间的相互作用会提高这一过程的效率。
图4. MTFP1依赖性的IMM重构靶向IMM亚结构域进行自噬降解
附图6. MTFP1富集的亚结构域和靶向自噬降解的小线粒体表现出线粒体功能障碍
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富含MTFP1的线粒体将多种IMM内容物转运给自噬小体
为了在更可控的条件下研究IMM亚结构域的自噬靶向，研究人员使用了在MTFP1-KO背景下稳定表达Flag-MTFP1的细胞系，该细胞系的线粒体网络形态(图S1G-S1I)和mtDNA拷贝数与WT细胞类似(图3D)。结果显示，未用氯喹(CQ)处理时，几乎无法检测到SMEM的存在(图5A和5B)。然而用CQ处理后，SMEM的形成量显著增加(图5A-5C)。并且SMEM与LAMP1、LC3B和p62均存在共定位，说明SMEM能够运输到自噬体和溶酶体(图5D和5E)，并且在LAMP1表达量高部位观察到了核周SMEM簇，这是成熟自噬溶酶体的典型位置(图5F)。最后，研究人员在稳定表达Flag-MTFP1的MTFP1 KO细胞中敲低FIS1或MFF并用CQ处理，发现敲低FIS1显著减少了SMEM的形成(图5G-5I)，这证实FIS1介导的外周分裂在这一过程中发挥了重要作用。综上所述，富含MTFP1的IMM亚结构域通过外周分裂被分离，并靶向自噬降解。为了探究富含MTFP1的线粒体(SMEM)中所运输的物质，研究人员利用共聚焦显微镜分析发现，这些线粒体中存在多种蛋白质，其中含量最高是PHB2（小编注：PHB2分布于细胞质、线粒体和细胞核中，参与信号转导、代谢、凋亡等重要生理过程，是一种高度保守和普遍存在的胚胎蛋白。PHB2在细胞自噬过程中，作为线粒体内膜的一个重要受体与LC3结合，参与线粒体自噬的调控）(图5J和5K)。另一方面，在SMEM中几乎不含有OPA1。值得注意的是，在氯喹(CQ)处理6小时后，mtDNA和TFAM分别存在于15%和20%的SMEM中，这表明这种质量控制机制并非只针对mtDNA。此外，CQ处理16小时后，每个细胞中的mtDNA拷贝数和拟核数量并未增加，表明自噬性拟核周转是一个相对缓慢的过程(图S6A、S7A和S7B)。但是研究人员发现，在MTFP1-KO细胞中，出现了免疫原性双链RNA(dsRNA)显著积累(图S7C)，这表明维持足够的拟核清除率可防止未来形成有害的线粒体核酸。
拓展阅读
LAMP1\LC3B\P62与自噬途径
LAMP1主要存在于溶酶体膜上，是一种高度糖基化的糖蛋白。TMEM175释放溶酶体中的质子，LAMP1可以抑制TMEM175，从而保持溶酶体的酸性环境，增强水解酶的活性；LC3I被Atg4水解切割掉C端5肽，暴露出甘氨酸残基，被泛素样体系修饰后与磷脂酰乙醇胺共价结合，形成LC3-Ⅱ，特异性附着在自噬体膜上，促进自噬体膜的延伸和闭合；P62是一种重要的选择性自噬接头蛋白。它通过自身磷酸化，连接泛素化蛋白和LC3/Atg8，通过PB1发生寡聚化，进入自噬溶酶体完成泛素化底物的降解。
参考文献：
图5. IMM结构改变后的外周MTFP1再分配和SMEM形成与mtDNA无关
附图7. MTFP1可以识别IMM结构的改变，而非mtDNA的损伤
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MTFP1依赖性的IMM亚结构域移动调控mtDNA回收
最后，为了探究MTFP1如何筛选大量的需要被回收的mtDNA。研究人员使用高通量测序技术(NGS)发现(图6A)。在野生型和MTFP1基因敲除的细胞系之间，同质或异质性线粒体单核苷酸变异(mtSNVs)并没有显著差异(图6B)。此外，9种常见的异质性mtSNVs的变异等位基因频率(即异质性水平)在野生型和MTFP1基因敲除组之间也没有差异(图6C)，这表明MTFP1驱动的mtDNA回收不能区分不同的mtDNA等位基因。
接下来使用稳定表达Flag-MTFP1的MTFP1-KO细胞系来监测mtDNA损伤过程中MTFP1的动态变化。在对照组中，MTFP1均匀分布在IMM，而在添加EB后，蛋白质重新分布在线粒体外周并形成小线粒体(图6D)。研究发现只有20%的具有MTFP1的外周IMM亚结构域存在DNA，表明MTFP1的重新分布不依赖于mtDNA。值得注意的是，PHB2在这些亚结构域上富集(图6F)，这表明并不是所有的IMM蛋白都重新分布到这些外周区域。有研究表明，每个拟核都在一定范围内与它们编码的产物存在物理连接。并有新研究基于该研究，发现了mtDNA改变会使外周IMM亚结构域形成生理缺陷，这种有缺陷的IMM亚结构域可能会作为信号分子来去除该结构域内的DNA。EB处理破坏了mtDNA，进而损害了线粒体的超微结构。因此，研究人员推测MTFP1可能可以识别IMM的改变。研究人员通过使用SR SIM技术发现，MTFP1主要在mtDNA周围的IMM上分布，而非在拟核周围分布(图6G)。与对照组相比，短暂沉默ATP合酶的亚基ATP5A也会导致MTFP1向线粒体外周和小线粒体移动(图S7D)。此外，通过抑制ATP5A或MICOS亚基MIC60来破坏嵴结构，增加了SMEM靶向自噬溶酶体结构的能力(图6H-6K)。而通过添加碳基氰化物m-氯苯肼(CCCP)造成线粒体膜电位缺失或通过米托paraquat60造成线粒体内ROS增加，不会使MTFP1有任何移动（图S7D和S7E)，也不会促进SMEM形成(图6H-6M)。以上结果表明，SMEM与线粒体功能障碍息息相关(图S6B和S6C)，而MTFP1在IMM结构改变时会被特异性激活。最后，持续三天敲减ATP5A或MIC60的表达水平并不会导致mtDNA的丢失(图S7F)。这一结果表明，虽然mtDNA的损伤会引发IMM的改变和MTFP1的重新分配，但IMM的结构缺陷并不一定会导致mtDNA的降解。
为了证实这一发现，研究人员又在MTFP1-KO细胞中重复这一过程。首先，通过使用Mito-Keima探针发现，由ATP5A或MIC60抑制引起的嵴缺陷会导致野生型(WT)细胞发生线粒体自噬，而敲除MTFP1基因的细胞中不会发生这种情况(图7A，7B)。研究人员通过使用PHB2标记SMEM，进一步证实了氯喹(CQ)处理会导致细胞自溶酶体结构中PHB2(+)/TOMM20(-)线粒体的水平增加(图7C)。通过抑制MIC60的水平来破坏IMM结构，可以显著增加野生型细胞中这些IMM亚结构域向溶酶体的靶向性，但敲除MTFP1之后，则不会出现这种情况(图7C–7F)。同样，与缺乏MTFP1的细胞相比，野生型细胞中经EB处理后的溶酶体内出现PHB2(+)膜的比例显著增加(图S7G–S7I)。重要的是，这些受损的IMM区域的出现与MTFP1的缺失没有关系，证实了这些膜重新排列的初始阶段不需要MTFP1。相反，在第二步中，MTFP1将它们隔离，防止它们与网络融合，从而促进它们在外周分裂为小线粒体。事实上，对EB处理的U2OS细胞的TEM分析显示，MTFP1-KO细胞中积累了异常的IMM结构(图7H和7I)。总的来说，这些数据证实，MTFP1与清除出现缺陷的IMM相关。
图6.IMM结构改变后，MTFP1在外周的重分布和SMEM的形成与mtDNA无关
图7. 回收发生变化的IMM亚结构域需要MTFP1
总结
在本研究中，研究人员发现MTFP1可以通过抑制具有缺陷的线粒体内膜融合，并导致其从线粒体网络中分离并被自噬降解。过量表达的MTFP1会向线粒体外周聚集，抑制IMM的融合，使受损的IMM亚结构域外周分裂脱离原来的线粒体，最后被自噬降解。这种IMM质量控制可以维持足够的mtDNA水平 。具体机制为，MTFP1通过抑制线粒体融合，从线粒体网络中分离和排除受损的IMM子结构域。随后，通过外周分裂形成富含MTFP1的小线粒体(SMEM)，这些线粒体最终以自噬依赖的方式降解。本研究为线粒体质量控制、mtDNA调控和线粒体相关疾病的治疗提供新的见解。本文阐明了线粒体通过外周分裂产生无法融合的小线粒体来排除无法通过质控的受损线粒体部分，并最终通过自噬途径降解这些小线粒体。此前认为通常情况下线粒体外周分裂中不含mtDNA；这可能由于此前关于mtDNA稳态调控的研究较少有关；其次与SMEM中mtDNA所占有的比例较低也有很大的关联，如前文结果显示在CQ抑制自噬的条件下，也仅在15%的SMEM中检测到了mtDNA，暗示MTPF1介导的这种质量控制机制并非只针对mtDNA。
原文链接：https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(24)00526-9?_returnURL=https%3A%2F%2Flinkinghub.elsevier.com%2Fretrieve%2Fpii%2FS0092867424005269%3Fshowall%3Dtrue&__cf_chl_tk=2Ru3tdh_5lONHhluWcUib1BQoHZKPlGBmfRo.hbk3pg-1721718136-0.0.1.1-7978#secsectitle1555
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