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撰文 | 李欣茜 张婷 仲银召 郑宇含 张彦康 李雨
编辑 | 孟美瑶
校对 | 张婷
背景介绍
肝脏具有高度的代谢灵活性，能在各种复杂条件下迅速做出反应，调整代谢活性以满足机体需要。例如，在进食期间，肝脏会激活脂肪酸从头合成（DNL）、糖原合成和蛋白质合成等合成代谢途径，而在禁食期间肝脏则会转变为几乎相反的代谢状态，激活脂肪酸氧化、糖异生（GNG）和蛋白质分解等。通常认为，是激素发挥作用阻止这些代谢相反途径的同时激活。例如，进食后的胰岛素信号会促进DNL相关酶的转录和翻译后激活，同时抑制GNG。相反，在禁食时，低胰岛素和高胰高血糖素信号会抑制DNL并激活GNG。然而，代谢物也可以通过变构效应、浓度效应、调节氧化还原状态及信号转导等多种方式调控代谢。因此，代谢物介导的这些机制很有可能参与肝脏代谢调控。
乙酰辅酶A（CoA）和丙二酰辅酶A是调控肝脏代谢的经典代谢物。乙酰辅酶A是β-氧化的产物，也是DNL的前体。乙酰辅酶A羧化酶（ACC）能催化乙酰辅酶A生成丙二酰辅酶A。ACC具有不同亚型，其中，ACC1位于细胞质中，催化产生的丙二酰辅酶A主要用于合成长链脂肪酸（LCFAs）（DNL），或延长必需脂肪酸的脂肪酸链（FAs，如亚油酸和亚麻酸）从而产生长链多不饱和脂肪酸（PUFAs）；而ACC2则位于线粒体膜上，催化产生的丙二酰辅酶A可以抑制肉碱棕榈酰转移酶1（CPT-1，促进LCFAs转运进线粒体），从而抑制β-氧化（小编注：ACC1和ACC2是ACC的两种亚型，在氨基酸序列上具有75%的相似性，主要区别是ACC2包括了一个特有的N端结构域，帮助其定位到线粒体。尽管ACC1和ACC2都能够催化乙酰辅酶A生成丙二酰辅酶A，但亚细胞定位的不同决定了其下游功能的不同。相比于ACC1主要在细胞质中生成丙二酰辅酶A，ACC2主要在线粒体外膜催化产生丙二酰辅酶A，而CPT-1同样位于线粒体外膜且丙二酰辅酶A会变构抑制CPT-1的LCFAs转运功能，因此ACC2产生的丙二酰辅酶A会通过调控CPT1活性参与抑制脂肪酸β氧化。进一步的，ACC1和ACC2的不同功能也与它们在不同组织中的表达差异有关。ACC1在脂肪生成相关组织如肝脏和脂肪组织中表达量较高，而ACC2则主要在脂肪酸氧化相关组织如心肌和骨骼肌中表达。此外，线粒体β氧化并不仅仅只受ACC2调控，一方面，β氧化调控本身是一个复杂的过程，β氧化相关酶本身表达及活性都受到多种因素调控，如PPARα在转录层面上调控CPT1、MCAD等多种β氧化相关酶的表达。另一方面，ACC2本身也不是直接参与β氧化的酶，而是通过其代谢产物丙二酰辅酶A进一步调控β氧化）。禁食期间，由于胰岛素水平降低、胰高血糖素升高和AMP依赖性蛋白激酶（AMPK）活性增加，ACC1/2活性被抑制，导致DNL减少，脂肪酸氧化被激活。值得注意的是丙二酰辅酶A水平降低后激活β-氧化引发的进一步代谢改变也与其他禁食相关特征相关联。β-氧化产生的线粒体乙酰辅酶A变构激活丙酮酸羧化酶（PC），催化丙酮酸转化为草酰乙酸（OAA）。OAA和其他三羧酸循环（TCA循环）中间产物可为GNG提供原料（小编注：OAA需要穿梭到胞质再进行。OAA需要经磷酸烯醇丙酮酸羧激酶（PEPCK）催化形成磷酸烯醇丙酮酸（PEP），才能参与GNG。由于PEPCK有不同的定位，OAA穿梭到胞质的方式也有所不同。当PEPCK位于线粒体基质中时，PEPCK可以直接催化OAA生成PEP，PEP再经线粒体内膜上的转运蛋白运到胞质中，参与GNG。当PEPCK位于细胞质基质时，不能直接催化线粒体中的OAA形成PEP，就需要线粒体基质中的苹果酸脱氢酶（MDH）或天冬氨酸氨基转移酶（GOT）催化OAA形成苹果酸或天冬氨酸，再经线粒体内膜上的转运体将苹果酸或天冬氨酸运到胞质中，在胞质中MDH或GOT作用下重新生成OAA，最后再由胞质中的PEPCK将OAA转变成PEP。PEP沿着糖酵解6步连续的逆反应形成1,6-二磷酸果糖，在1,6-二磷酸果糖磷酸酶的催化下水解为6-磷酸果糖，再经6-磷酸葡糖磷酸酶水解产生葡萄糖，完成GNG），维持机体内能量与氧化还原稳态，并可能进一步与各种转录因子相互作用（小编注：TCA循环的中间产物能与转录因子相互作用，调控基因表达。例如，乙酰辅酶A可以调节一些转录因子（如Smad2）的乙酰化，进而参与调控基因表达。延胡索酸和琥珀酸有助于提高抗氧化转录因子（如 Nrf1/2、Hif-1和If1）的稳定性，促进细胞抗氧化能力）。因此，丙二酰辅酶A可能会通过以上这些机制参与多种代谢途径的调控。
ACC1/2缺失会抑制丙二酰辅酶A和DNL，激活脂肪酸氧化，减少肝脏甘油三酯（TG）水平，ACC抑制剂也复现出了这些结果，并已应用于治疗代谢紊乱相关脂肪肝病（MASLD）的临床试验。然而，抑制ACC1/2也可能带来负作用，例如通过抑制PPARα信号及激活SPEBP-1促进TG分泌，引发高血脂（小编注：关于缺失ACC的影响的研究仍存在矛盾的地方，例如，有研究表明用ACC1/2抑制剂MK-4074治疗脂肪肝患者，能显著降低患者肝脏TG水平，但会显著促进血浆TG水平。进一步的研究表明，缺失ACC1/2会抑制丙二酰辅酶A合成，降低肝脏中的多不饱和脂肪酸 (PUFA) 浓度，而PUFA浓度降低能显著激活SREBP-1，SREBP-1是肝脏脂肪酸和TG生成的关键转录因子，促进GPAT1表达。GPAT1利用来自脂肪组织的脂肪酸合成TG，并形成VLDL，分泌至血浆中，引发高血脂。此外，据报道，缺失ACC会抑制PPARα信号，促进肝脏脂肪酸氧化，而回补PPARα后，正常情况下要纳入VLDL分泌出肝脏的TG就会被氧化，降低血浆TG水平，因此这里说抑制PPARα可能促进TG分泌，引发高血脂）；此外，缺失ACC1/2还可能激活糖酵解、细胞增殖和肿瘤发生等。然而，抑制ACC后为何会出现这些意料之外的作用仍不清楚。本文中，研究人员做出假设，抑制ACC后，丙二酰辅酶A合成减少，进一步通过代谢物介导的机制引发其他反应，并利用药物抑制ACC或肝脏特异性双敲除ACC1/2基因（LDKO）小鼠模型验证了该假设并探索了具体机制，发现肝脏ACC活性降低后，丙二酰辅酶A水平降低，在进食状态下通过激活CPT-1，促进丙酮酸羧化酶活性从而促进糖异生；而在禁食状态下通过调控蛋白质稳态促进氨基酸水平增加，进一步激活糖异生，阐明了代谢物丙二酰辅酶A在调控肝脏代谢中的重要作用。
研究结果
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研究人员发现，肝脏ACC1/2基因缺失会导致肝脏丙二酰辅酶A（malonyl-CoA）水平显著降低（图1B），已知丙二酰辅酶A是DNL（从头脂肪合成）的底物，其减少可降低DNL并刺激脂肪酸氧化。为了检测肝脏特异性敲除ACC1/2基因小鼠（LDKO小鼠）肝脏的脂质合成，研究人员给正常饮食的WT和LDKO小鼠饮用2H2O，然后用1H和2H NMR光谱（核磁共振光谱）进行分析，通过1H和2H的富集程度来量化新TG（甘油三酯）的含量和来源（DNL、伸长、去饱和及酯化）（图 S1A）。实验结果表明，与WT相比，LDKO小鼠肝脏中的总脂肪酸含量下降，包括二十二碳六烯酸（DHA）、ω-3脂肪酸和其他PUFAs（多不饱和脂肪酸）（图1C，S1B、S1D和S1E），且LDKO小鼠肝脏TGs的甲基、α2和烯烃中氢位置的2H富集减少（图S1C和S1F），这与LDKO小鼠肝脏DNL、伸长和去饱和水平受到抑制的结果相对应（图1D和S1G）。与之相反的是，在LDKO小鼠肝脏中甘油上富集的2H和新酯化的TG上富集的2H水平增加（图 S1H）。这与研究人员之前的发现一致，即ACC的缺失抑制了DNL，但促进了FA酯化和TG分泌（小编注： TG分泌指肝脏TG与磷脂、胆固醇和载脂蛋白结合生成VLDL，分泌进入血液循环的过程，这是肝脏TG分泌到血液中的主要形式）。这些影响伴随着脂肪组织中脂肪生成基因的上调（图S1I）。研究人员还发现，LDKO肝脏中的中链和短链酰基肉碱比例更高（小编注：脂肪酸β氧化过程的关键酶为CPT1，负责催化胞质中的脂酰辅酶A转化为脂酰肉碱，转运到线粒体内，进行氧化分解。因此研究人员检测脂酰肉碱水平，来评估肝脏中CPT1活性和β氧化水平），这提示LDKO小鼠肝脏中CPT1活性和β-氧化水平升高（图1E）。随后研究人员对LDKO小鼠禁食后再进食，结果显示，LDKO小鼠血浆和肝脏中酮体水平显著升高，且LDKO小鼠肝原代细胞上也证实了酮体生成的增加（图1F-H）。最后，为了证实这一现象是由肝脏ACC抑制而引起的，研究人员用不同剂量的MK-4074（一种肝脏特异性ACC1/2抑制剂，在人类和小鼠中已证明可抑制DNL）处理WT小鼠，结果显示MK-4074处理2h后显著促进小鼠血浆中酮体含量，且呈剂量依赖性（图1I）。这些数据表明，肝脏ACC介导的丙二酰辅酶A生成对于促进DNL途径和抑制FA氧化途径至关重要。
图S1.脂质代谢的1H和2H NMR分析
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在进食状态下，丙二酰辅酶A可抑制肝脏GNG（糖异生）
图2.肝脏 ACC1/2缺失会促进小鼠的GNG
图S2.血浆葡萄糖质量同位素的代谢通量分析
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过夜禁食会降低肝脏丙二酰辅酶A含量（图4A），这可能会挽救LDKO小鼠表型。令人惊讶的是，禁食处理后，LDKO小鼠空腹葡萄糖水平显著升高，且在禁食期间LDKO小鼠可抵抗血糖的正常降低，但LDKO小鼠肝脏糖异生基因表达无明显变化（图4B-C和图S4A），提示LDKO小鼠抵抗禁食期间血糖下降并不是由基因调控，而是一种代谢调控机制。利用依托莫西抑制CPT-1显著降低了禁食期间LDKO小鼠血糖水平（图S4B）。然而，禁食状态下WT和LDKO小鼠肝脏乙酰辅酶A水平无明显差异（图4D），因此LDKO小鼠肝脏中PC活性可能并未激活。但是，禁食后LDKO小鼠肝脏TCA循环中间产物水平升高（图4E和图S4C），这与进食状态下的结果类似。并且，禁食后LDKO小鼠肝脏乳酸和丙酮酸水平也显著升高（图4F），这表明禁食后LDKO小鼠肝脏的底物供应水平增加或者底物利用率降低。为了检测禁食后LDKO小鼠肝脏乳酸和丙酮酸增加的原因和作用，研究人员对禁食WT和LDKO小鼠肝脏灌注乳酸和丙酮酸，结果显示，与WT小鼠相比，灌注乳酸或丙酮酸后显著促进了LDKO小鼠肝脏的葡萄糖生成（图4G），这表明禁食后LDKO肝脏乳酸和丙酮酸的升高源于底物供应的增加而不是利用率的降低。此外，与LDKO小鼠相比，在LDKO小鼠中敲除PEPCK-C基因显著降低了血糖水平。因此，禁食后LDKO小鼠空腹血糖升高需要GNG，且GNG的升高与底物供应水平的增加相关（图4I）。
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图S5.13C标记的LPTT代谢通量分析数据
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进入TCA循环的谷氨酸/谷氨酰胺通量增加表明，氨基酸可能导致禁食LDKO小鼠体内回补前体过剩。事实上，当向LDKO小鼠或PMHs供给[U-13C3]乳酸/丙酮酸时，肝丙氨酸富集会被稀释，并迅速与丙酮酸达成平衡（图6A）。研究人员进一步发现，肝脏必需氨基酸（EAAs）和尿素循环氨基酸的含量在进食状态下基本不变，但在禁食时升高（图6B-C）。在LDKO小鼠肝脏中，几种非EAAs的含量也发生了变化，但不如 EAAs 那么显著或规律（图6D）。值得注意的是，肝支链氨基酸（BCAAs）在禁食期间升高，因为与其他EAAs一样，BCAAs在蛋白质分解过程中被释放，但不能直接被肝脏分解。事实上，WT小鼠肝脏中的BCAAs和其他EAAs在禁食期间略有下降，但在LDKO小鼠中则有所增加（图6E）。同样，WT小鼠肝脏丙氨酸在禁食后明显减少，这与GNG对丙氨酸的利用有关，但这种效应在LDKO小鼠中有所减弱（图6E）。体重减轻或体成分的系统效应不能解释氨基酸供给增加（图S6A-B）。此外，研究人员在另一组单独样本中对WT和LDKO小鼠的肝脏和血浆氨基酸进行匹配分析，证实LDKO小鼠肝脏氨基酸升高，但血浆氨基酸没有差异（图6F）。重要的是，LDKO小鼠肝脏维持肝内丙氨酸的能力与BCAA、乳酸和TCA循环中间产物浓度密切相关（图6G）。这些数据表明，LDKO小鼠禁食期间释放的氨基酸有肝内来源。
拓展阅读
[1] Joshua D. Rabinowitz and Eileen White. Science, 2010 Dec 3;330(6009):1344-8.
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鉴于禁食期间肝内脂肪和氨基酸通过大自噬和蛋白酶体途径释放，于是研究人员对小鼠进行24小时禁食处理，并于第4和20小时给小鼠注射具有高度肝脏特异性的蛋白酶抑制剂——亮抑蛋白酶肽（leupeptin）（小编注：leupeptin是一种广谱的、具有细胞膜渗透性的蛋白酶抑制剂。在2011年发表的Autophagy表明，经leupeptin处理后，LC3b（广泛使用的自噬标志物）的积累率在肝脏最大，在脾脏最低，所以本文研究人员认为其具有高度的肝脏特异性）。在整个实验过程中监测血糖，以检测LDKO小鼠是否需要通过蛋白水解来维持空腹血糖。研究结果表明，蛋白酶抑制使禁食LDKO小鼠的肝EAA和BCAA水平恢复正常（图6H）。此外，蛋白酶抑制使禁食血糖恢复正常（图6I），这与BCAAs的降低有关（图6J）。以上结果表明，蛋白水解导致LDKO小鼠禁食血糖升高。
亮抑蛋白酶肽还可抑制自噬体的溶酶体加工，并通过某些自噬体蛋白（如LC3-II）的积累以及将选择性物质（如p62/Sqstm1）运送到自噬体来评估大自噬通量。研究人员给小鼠注射亮抑蛋白酶肽后（禁食4h/24h），肝脏LC3-II积累，但在两种状态下，LDKO和WT小鼠的肝脏LC3-II都无显著差异（图6K和图S6C）。相比之下，磷酸化的（S351）p62在禁食24小时的LDKO小鼠肝脏中明显累积（图6L和图S6C），表明选择性自噬（比如线粒体自噬）升高。事实上，研究人员通过电子显微镜发现LDKO小鼠肝脏中的线粒体变小（图S6D），与增加的线粒体自噬一致。禁食状态下，独立于自噬体的微自噬和蛋白酶体介导的蛋白水解也会被激活，但分别直接发生在溶酶体或细胞质中。蛋白酶体在LDKO小鼠肝脏中的表达上调，尤其在进食状态下（图S6E）。因此，在禁食期间，LDKO小鼠肝脏氨基酸和血糖升高需要蛋白质分解，这可能涉及特定的蛋白质分解途径，如选择性自噬或蛋白酶体介导，但不能归因于一般的大自噬。
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随后研究人员探究了Akt和mTORC1信号通路，因为这些通路会影响肝脏中的氨基酸和蛋白质代谢。研究发现，进食状态下LDKO小鼠肝脏中的Akt磷酸化略有增加，但在禁食/再进食状态下减弱（图7A和图S7A）。然而，通过S6磷酸化显示的mTORC1信号转导正常（图7A和图S7A）。禁食小鼠门静脉注射胰岛素更倾向于诱导LDKO小鼠Akt和mTORC1信号（图S7B）。然而，由于mTORC1的激活可抑制蛋白分解和GNG，这些数据并不能解释LDKO小鼠的禁食表型。
Nrf2是一种对氧化还原反应敏感的抗氧化转录因子，也在自噬、蛋白酶体活性和生长中发挥作用。通过检测Nrf2的靶标蛋白HO-1和NQO1发现，其蛋白表达在进食和禁食的LDKO小鼠肝脏中均显著升高（图7B和图S7A），这表明Nrf2信号转导被诱导。Nrf2活性与肝脏BCAA浓度之间的相关性分析表明Nrf2与氨基酸来源之间存在关系（图7C）。值得注意的是，自由进食的小鼠单次服用ACC抑制剂2小时后，以剂量依赖的方式激发了Nrf2活性，并且与肝脏丙二酰辅酶A水平呈负相关（图7D和图S7C）。Nrf2通常会通过与Kelch样ECH相关蛋白（Keap1）结合而被降解，而这种结合又会被氧化应激阻断。因此，ACC1/2抑制期间的Nrf2激活可能是由于肝脏基础氧化代谢较高（图1和图3）导致。其他氧化还原因子，如胞浆NADH：NAD+（与乳酸：丙酮酸成比例）和NADPH：NADP+（与苹果酸：丙酮酸成比例）与急性ACC抑制后的Nrf2激活相关（图7E）。此外，升高的富马酸也可在相应情况下激活Nrf2（图7F）。最后，磷酸化的p62能有效促进Keap1的自噬降解，其含量在LDKO小鼠肝脏中增加，并与Nrf2的激活相关（图7G和图S7A），这一发现与蛋白酶抑制期间磷酸化p62的过量积累一致（图6L）。图7H总结了在急性和慢性ACC1/2活性丧失期间可能介导Nrf2激活的因素，但确切的机制还需要进一步研究。
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研究人员发现，较之WT小鼠，LDKO小鼠的肝脏增大25%（图7I），这不能归因于肝细胞更新、糖原、甘油三酯（图S7D）或脂滴含量（图S7E）。值得注意的是，与WT小鼠相比，禁食导致LDKO小鼠肝脏质量（图7J）和肝细胞大小（图S7F）减幅更大，这表明多余的肝脏质量可能是禁食LDKO小鼠的蛋白水解库。然而，这种情况同样需要LDKO小鼠在进食期间增加肝脏蛋白质合成来补偿禁食期间的蛋白质水解。因此，研究人员使用2H2O作为体内水分示踪剂，并在禁食12小时（基线）、禁食24小时（基线+额外禁食12小时）和复饲（基线+额外进食 12 小时）小鼠肝脏蛋白质裂解物中测定丙氨酸2H富集情况，以测量蛋白质合成情况（图S7H）。LDKO小鼠在基线禁食和额外禁食12小时之间的蛋白质合成正常增加，但复饲期间诱发了更多的蛋白质合成，这也与肝脏大小相关（图7K）。因此，LDKO小鼠在进食期间通过增加蛋白质合成来维持较大的肝脏质量，而在禁食过程中肝脏质量和肝细胞大小减幅更大。
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为了探究上述小鼠禁食表型是急性代谢还是慢性适应机制，研究人员比较了LDKO小鼠和急性药物ACC抑制剂处理小鼠的表型。首先，研究人员发现与对照组相比，单剂量MK-4074处理2小时的小鼠肝脏中Nrf2下游靶点、TCA循环中间产物和BCAAs显著上调，而禁食后无差异（图7L-N，图S7C和图S7G）。随后，研究人员用MK-4074处理小鼠5天，以探究更长的处理时间是否能重现禁食LDKO小鼠的表型。结果发现，在禁食后，对照组小鼠的血糖下降，LDKO小鼠能维持血糖，但MK-4074处理组小鼠的血糖与对照组无明显差异（图7O）。此外，与对照组相比，MK-4074处理组小鼠的肝脏柠檬酸盐含量升高，但TCA循环中间产物总量没有明显差异（图7P）。同样，与对照组相比，MK-4074处理的小鼠肝脏EAAs总量增加，但上调程度比LDKO小鼠低，而BCAAs含量无差异（图7Q）。重要的是，虽然肝脏大小与空腹肝脏BCAAs相关（图7S），但肝脏大小不受5天抑制剂处理的影响（图7R）。因此，肝脏中ACC1/2的慢性缺失通过调控蛋白稳态和氨基酸代谢的适应性变化，促进了禁食LDKO小鼠肝脏中的TCA循环中间产物和血糖水平，而单剂量ACC抑制剂处理不会急性诱导上述禁食表型，在抑制剂处理5天后才能重现部分禁食表型。
总结
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