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撰文 | 李姿萱 郭钰涵 刘梓棋 于柳 李章燕 周文豪 邱瑾
编辑 | 孟美瑶
校对 | 于柳
背景介绍
高度的代谢灵活性（小编注：身体有一套精密的程序：在饱食一顿富含碳水化合物的大餐后，机体会更多地燃烧葡萄糖来控制血糖；禁食时，机体更多地燃烧自身脂肪以节约有限的葡萄糖。这种在“燃糖”与“燃脂”之间切换的能力，被称作新陈代谢的灵活性，是健康的标志和特征。）能够帮助机体在资源匮乏时释放和利用能量，在资源丰富时储存能量。而在肥胖状态下，原本有益的动态代谢调节机制会对机体稳态产生负面影响，因此需要更深入地了解潜在的信号通路，为精准治疗肥胖相关疾病如2型糖尿病、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、高血压、血脂异常等提供新策略。早期肥胖会出现胰岛素抵抗、胰腺β细胞功能丧失、肝脏脂质积累（脂肪变性）等代谢功能障碍，在衰老过程中也会发生类似的变化，这表明不同代谢失调状态的潜在调节机制具有一定的联系。
活性氧（ROS）是驱动代谢失调的一个潜在因素，其含量会随着肥胖和衰老而增加。活性氧过高会扰乱细胞的氧化还原平衡，并损伤蛋白质、DNA、RNA等生物大分子。但正常生理范围内的ROS作为预警信号分子有利于机体稳态。目前尚不清楚ROS升高如何扰乱机体代谢功能，其潜在机制可能包括对大分子的不加区分的氧化损伤和代谢信号通路的调节。
应激激活的丝裂原活化蛋白激酶p38和c-Jun氨基末端激酶(JNK)可被多种细胞应激因子激活，如ROS、紫外线、热应激等。这些激酶发出的信号促使细胞进入不同的生命状态，包括细胞周期阻滞、细胞死亡、细胞分化、应激适应和炎症等。p38和JNK在代谢调节中的重要作用已在多种条件敲除小鼠模型中得到证实，研究表明，JNK可参与调节胰岛素敏感性、肝脏脂质代谢和脂肪因子的产生等生理过程。p38可以调节β细胞的稳态，并且可以调节脂肪组织的产热功能以及脂解。p38和JNK与肥胖和代谢综合征密切相关，靶向这两种激酶或其信号通路的某些组分可作为一种治疗或预防代谢性疾病的治疗方法。研究表明在高脂饮食下，JNK缺失可改善小鼠胰岛素抵抗，肝脏脂肪变性等代谢紊乱现象，这表明MAP激酶信号通路在调控代谢方面至关重要。
MAP2K和MAP3K等上游组分可以激活下游的MAP激酶，而这些组分中，最上游的MAP3K家族包含21种激酶，目前研究只明确了其中少数激酶的信号与激活机制。最近引发关注的一种MAP3K激酶——ZAKα，它可以与核糖体相互作用，是翻译损伤的感受器。ZAKα通过两个C端核糖体结合域与核糖体结合，当机体处于氧化应激等异常状态时，核糖体发生碰撞/停滞（小编注：核糖体碰撞：由于mRNA可能含有的二级结构形成障碍，烷基化或氧化带来的化学损伤，异常密码子序列等，导致核糖体移动速度过快的到达mRNA，彼此间距较短甚至接触形成二核糖体，有时甚至形成扩展队列（多聚核糖体），互相干扰，影响蛋白合成效率。核糖体停滞：当核糖体沿着mRNA的开放阅读框ORF伸长时，可能遇到异常的氨基酸组合，终止密码子或特定的RNA结合蛋白，从而减慢其从mRNA 5端-3端的移动），导致与核糖体相连的ZAKα被激活发生磷酸化，而ZAKα属于JNK/P38级联信号传导通路上游的激酶MAP3K中的一种，ZAKα磷酸化后进一步促进MAPKK再磷酸化并激活MAPK（JNK和p38都属于MAPK家族）, JNK/p38分子上的苏氨酸和酪氨酸残基被磷酸化，从而激活JNK/p38。这种可以监测核糖体功能，并将核糖体畸变信号转换为p38和JNK激活的途径被称为核糖体毒性应激反应(RSR)（小编注：RSR是核糖体毒性应激反应，是一种信号通路，指细胞在发生核糖体功能障碍或负荷过重时，激活的一系列生物学响应机制。核糖体停滞和碰撞是RSR的一个重要诱导因素，但它不等于RSR。RSR 的特征是激活 p38 和 JNK 丝裂原活化蛋白激酶。之前在神经系统退行性疾病、粘膜相关疾病（如溃疡性结肠炎和上皮癌）、肿瘤模型中被报道发挥作用。P38/JNK激活可转导细胞应激信号，影响细胞增殖（如可以抑制细胞周期相关蛋白(如Cyclin D1)的表达，从而抑制细胞的增殖、分化、存活和迁移。ZAKα能够感受核糖体的停滞和碰撞造成的翻译损伤，激活p38和JNK从而实现信号转导RSR）。然而，生物体中核糖体停滞、碰撞并引起RSR激活的信号暂不明确（小编注：以往研究中，有人对哺乳动物细胞进行核糖毒素酶、抗生素或紫外线照射等处理以损伤核糖体或mRNA模板，以此探明RSR功能。然而，引发生物体中核糖体停滞、碰撞以及RSR激活的生理来源仍不明确；此外，核糖体停滞、碰撞后引发的RSR激活在机体中能发挥什么样的作用也尚不明确）。在本研究中，研究人员发现ROS可以激活ZAKα和下游RSR信号。在肥胖和衰老过程中，RSR通路介导了不良的代谢转变，如葡萄糖耐量异常和肝脏脂肪变性，本文揭示了MAP激酶调控代谢的机制，并指出核糖体是新的代谢压力感受器。
1. ROS诱导核糖体停滞，抑制蛋白合成并激活RSR
2. ZAKα和ASK1促进ROS诱导的p38和JNK激活
3. ZAK KO小鼠可以抵抗肥胖和衰老过程中的代谢紊乱
4. ZAK KO小鼠在肥胖和衰老过程中BAT结构和功能退化减弱
研究结果
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氧化应激和ROS都能抑制翻译过程并激活p38和JNK。为了寻找这些效应之间的潜在联系，研究人员用甲萘醌（小编注：甲萘醌/Mena又名维生素K3，能刺激细胞产生ROS）处理U2OS细胞（人类骨肉瘤细胞），发现细胞中的p38被激活(图1A)。研究人员用ZAK激酶抑制剂ZAKi和甲萘醌处理WT U2OS细胞和以及用甲萘醌单独处理ZAK敲除的U2OS细胞（△ZAK）均发现p38完全失活(图1B)。进一步研究发现，只有能与核糖体结合的ZAK-α亚型与p38激活有关（敲降ZAK-α抑制p38激活），无核糖体结合域的ZAK-β亚型则无明显效应(图1C，D) ，因此推测甲萘醌可以通过ZAK-α激活RSR，为了进一步验证这一假设，研究人员对WT U2OS和△ZAK U2OS细胞进行了嘌呤霉素结合实验和挽救实验（小编注：嘌呤霉素是一种蛋白质合成抑制剂,它具有与tRNA分子末端类似的结构, 能够同氨基酸结合，代替氨酰化的tRNA同核糖体的A位点结合，并掺入到正在生长的肽链中，形成嘌呤霉素标记的新生肽链而不能进一步延伸。图1E是用NAC (10 mM)预处理U2OS细胞1h，然后按指示添加甲萘醌(250 mM)或茴香霉素(1 mg/ml)处理1h，收样前10分钟在培养液中加入10 mg/ml的嘌呤霉素(puromycin)，用puromycin抗体进行免疫印迹分析。从图中可以得知，加入嘌呤霉素后，添加甲萘醌的两个处理组中的条带明显浅于未加甲萘醌的处理组（暗示甲萘醌处理使核糖体功能受损，蛋白质合成效率降低。图1F：挽救实验，即针对U2OS细胞、ΔZAK细胞（敲除ZAK）、ΔZAKα（敲除ZAKβ）、ΔZAKβ（敲除ZAKα）、ΔZAKαΔΔ（敲除α的 "S "和 "CTD "结构域），展开Rescue实验，发现只有ZAK中功能性核糖体结合域“S”和“CTD”存在时才能够激活p38），结果显示，甲萘醌显著抑制了核糖体的翻译功能，促进了eIF2α的磷酸化（小编注：核翻译起始因子（eIF2α）是重要的翻译起始因子，通过其磷酸化调节细胞相关基因的转录和翻译。eIF2α的磷酸化会导致总蛋白合成减少，但会促进转录因子ATF4、ATF5和CHOP的产生（当eIF2α被磷酸化时，这些转录因子在其信使核糖核酸中含有促进翻译的调节元件）。Guo, X., Aviles, G., Liu, Y. et al. Mitochondrial stress is relayed to the cytosol by an OMA1–DELE1–HRI pathway. Nature 579, 427–432 (2020). ），激活了综合应激反应(ISR）（小编注：ISR是综合应激反应，可以整合细胞内的各种应激状态，包括蛋白质稳态失调、营养缺乏、病毒感染和氧化还原失衡，ISR作为信号中心调控网络，主要以控制蛋白质合成速率来实现，通过四种eIF2α激酶HRI（EIF2AK1）、PKR（EIF2AK2）、PERK（EIF2AK3）、GCN2（EIF2AK4）来调节eIF2α磷酸化，从而激活ISR，抑制整体的翻译，但增加了特定的转录因子的翻译，如CHOP、ATF4和ATF5）（图1E），并且发现ZAK-α 中的功能性核糖体结合域（S和CTD；其中αΔΔ代表“S”和“CTD”结构域删除）是激活p38必不可少的位点（图1F）。
研究人员发现，甲萘醌处理对细胞的影响是可逆的，甲萘醌预处理细胞1h后，去除甲萘醌继续用活性氧清除剂N -乙酰半胱氨酸(NAC)处理，随着时间延长，能够观察到细胞中核糖体翻译功能恢复，p38磷酸化水平下降(图1G)，NAC预处理细胞能够消除上述所有甲萘醌处理对细胞造成的影响(图1E和图S1A)。除甲萘醌外，其他可以促使细胞产生ROS的化学试剂如β-lapachone（促进ROS生成）和硫氧还蛋白还原酶抑制剂金诺芬（Auranofin）也能以同样的方式减少核糖体翻译水平，激活p38和JNK(图1H-J，图S1 B-D)。以上结果表明，ROS暴露可激活细胞中的RSR信号（小编注：之前研究发现ROS能够抑制翻译并激活p38和JNK，但并未提到ROS激活p38与JNK的分子机制，作者想要证明ROS是如何将核糖体的损伤信号传递给p38与JNK所在的MAPK通路，ZAK作为RSR反应的一个连接点，即ROS引起核糖体的停滞与碰撞，从而激活ZAKα，ZAKα感受到核糖体的损伤后将这种信号传递给了p38和JNK，导致了p38与JNK的激活，上述的信号转导的通路即RSR）。
图1. ROS抑制翻译并激活RSR
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ZAKα可以感受到核糖体的停滞和碰撞信号。为了探究ROS诱导RSR活化的机制，研究人员用微球核酸酶（MNase）消化多聚核糖体，并利用蔗糖梯度来分离不同质量的核糖体，结果显示，用甲萘醌处理U2OS细胞30min或1h后，代表大量核糖体堆积的多聚核糖体峰没有增加 (图2A，图S1E左)，而用β-lapachone（促进ROS生成）处理U2OS细胞30min后，核糖体堆积的数量轻微增加(图S1F左)，而在使用蛋白质合成抑制剂茴香霉素处理细胞1h后，核糖体堆积的数量显著增加(图S1G)。先前有研究报道，氨基酸剥夺会延长核糖体的停滞，但这些停滞的核糖体只有在ISR被抑制时才会导致核糖体的堆积。由于ROS能够激活ISR，研究人员想进一步探究ISR是否能够抑制甲萘醌（刺激细胞产生ROS）和β-lapachone引起的核糖体堆积，研究人员在加入甲萘醌和β-lapachone 30min后，使用ISR抑制剂ISRIB处理细胞，结果发现，该处理促进了核糖体的堆积水平(图2A，图S1F，S1H)，但核糖体堆积持续的时间比较短暂，在1h和2h时几乎检测不到(图S1E)。这些数据表明，细胞对ROS激活剂敏感，能够引发核糖体的停滞和碰撞，并且高水平的ROS会在之后抑制翻译的起始作用。而事实上，不同处理情况下的多聚核糖体（小编注：指多个个核糖体串联附着在同一条mRNA上）都会随着处理时间的延长而减少，即使加入ISRIB也无法逆转多聚核糖体的减少(图S1I，J)。研究人员用三尖杉酯碱（HTN）（能抑制核蛋白的合成，促进多聚核糖体的解聚）靶向处理，发现核糖体在肽链延伸过程中从mRNA上迅速解离(图2B，左)，而甲萘醌处理能够抑制核糖体在HTN处理情况下从mRNA上解离的水平(图2B，右)，进一步说明了ROS能够减缓或阻止核糖体的延伸，从而阻止核糖体从mRNA上解离下来。与上述结果一致，与茴香霉素（蛋白质合成抑制剂）处理相比，经甲萘醌（刺激细胞产生ROS）处理的细胞的核糖体富集颗粒中，所有核糖体碰撞生化标记物（EDF1、泛素化的RPS10和ZNF598）和起始生化标记物（泛素化的RPS2）均为阴性（小编注：因为甲萘醌可以通过ROS引起核糖体停滞，但ROS会促进ISR，而核糖体停滞不代表核糖体碰撞堆积，只有在核糖体停滞并且ISR被抑制的时候才会发生碰撞，所以甲萘醌处理之后核糖体碰撞生化标记物为阴性。EDF1可以感受到核糖体碰撞，并且抑制翻译。ZNF598是一种泛素化酶， RPS10和RPS2是小亚基上面的核糖核蛋白，是ZNF598下游的靶点，受核糖体碰撞激活,随后就会被降解，从而抑制翻译过程。这些都是核糖体碰撞的Marker。Garzia A, Meyer C, Tuschl T. Cell Rep. 2021;36(5):109468. Juszkiewicz, Szymon et al. eLife vol. 9 e60038. 13 Jul. 2020. Juszkiewicz S, Hegde RS. Mol Cell. 2017;65(4):743-750.e4.）（图S2A和S2B）。此外，研究人员用甲萘醌和金诺芬处理细胞后发现，与GCN2相比（小编注：GCN2是氨基酸传感器，能通过磷酸化真核翻译起始因子eIF2α抑制翻译起始，负调蛋白翻译），ROS主要是通过另一种调控eIF2a的激酶—内质网(ER)应激反应激酶PERK来抑制核糖体延伸的（图2C和图S2C）。结合上述结果以及先前的研究表明，急性ROS暴露时ZAKα的激活不会引起大范围的核糖体堆积碰撞，而是会很大程度上导致单个核糖体的减速和停滞(图S2D)。研究人员用内质网应激诱导剂，毒胡萝卜素（thapsigargin），处理WT U2OS和△ZAK U2OS细胞，发现毒胡萝卜素能够强烈抑制核糖体翻译并诱导ZAKα激活(图S2E-G)，说明内质网应激和核糖体毒性应激(RSR)的触发因素具有重合性。
ROS可能会破坏DNA和RNA中的核苷酸，有研究表明，核糖体RNA (rRNA)和mRNA碱基的氧化修饰与翻译损伤有关。为了探究翻译过程中对ROS敏感的组分，研究人员以HeLa细胞裂解物为底物，设计出一个由三部分组成的体外翻译系统(图2D)，甲萘醌能够诱导该细胞系激活p38，抑制蛋白质翻译过程，而活性氧清除剂N -乙酰半胱氨酸(NAC)能够消除甲萘醌处理对细胞造成的影响(图S2H, I)。研究人员从HeLa细胞中分离出核糖体，以及含有tRNA、起始和延伸因子的无核糖体细胞质部分，这两部分在结合后就能启动体外转录的编码荧光素酶的mRNA翻译过程(图2D, 图S2J)。为了在体外翻译系统中引入氧化损伤，研究人员每次用过氧化氢处理三种组分（核糖体，无核糖体的细胞质部分以及编码荧光素酶的mRNA）中的一种，每次处理10分钟，随后用过氧化氢酶中和过氧化氢，然后将各组分组合并确定荧光素酶蛋白的产生量。令人惊讶的是，使用过氧化氢处理核糖体或编码荧光素酶mRNA并不会影响翻译功能，而使用过氧化氢处理无核糖体的细胞质部分会抑制mRNA的翻译(图2E)。与此不同的是，用能够引起核糖体堆积的UVB照射处理三种组分，则主要通过影响mRNA组分来降低翻译效率(图2F)。研究人员还直接从甲萘醌和NAC处理的HeLa细胞中制备了核糖体和细胞质部分(图2G)，结果表明，无核糖体的细胞质部分中含有一种或多种可溶性的对ROS敏感的组分(图2H, I)。对此，研究人员开展了生物素转换试验，发现一些相关的翻译起始和延伸因子在经甲萘醌处理后，并没有发生半胱氨酸的氧化，说明ROS并没有影响翻译起始和延伸因子的活性(图S3A)，细胞质部分也并未发现tRNA的大规模降解(图2J)，然而， Northern印迹结果显示，甲萘醌诱导的tRNA Arg-TCT条带出现了明显的割裂，NAC处理后条带恢复(图2K)，在tRNAs Leu-CAA、Gly-GCC和iMet-CAT的Northern印迹结果中也观察到相似的结果 (图S3B-D)，但甲萘醌处理对tRNA装载氨基酸的能力无显著影响(图S3E)。血管生成素是一种切割tRNA的核糖核酸酶，细胞受到应激损伤时会被激活（小编注：有文献表明血管生成素可以通过发挥核糖核酸酶的功能切割miRNA促进血管的生成。如https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35228896/发现血管生成素通过降解结直肠癌中 miR-141 促进血管生成。https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/26272182/发现肿瘤细胞可以分泌血管生成素通过抑制miR-542-3p诱导内皮细胞的血管生成活性）。近期有研究表明，甲萘醌能够激活血管生成素并引起之后的tRNA切割。以上结果表明，ROS 诱导剂在体内实验和体外实验中均能够干扰翻译，并激活ZAKα和RSR。
图2. ROS诱导的ZAKα活化与核糖体停滞和碰撞有关
附图1. ROS诱导的翻译抑制是可逆的，与核糖体的停滞和碰撞有关
附图2. ROS不会引起大范围的核糖体堆积，主要通过PERK激活综合应激反应
附图3. 甲萘醌诱导细胞中tRNA切割
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ZAKα和ASK 1的叠加作用促进ROS诱导的p38和JNK激活
研究人员用甲萘醌处理U2OS细胞发现，随着时间推移，p38被激活两次，一次在暴露后5min开始，在10-15min达到峰值，另一次是在45min时开始，在1-2h达到峰值(图3A)，然而只有第二个峰与ISR激活、翻译终止和氧化蛋白的出现相吻合(图3A和图S3F)。研究人员用甲萘醌分别处理ZAK敲除、ASK1（MAP3K家族激酶之一）敲除以及ZAK和ASK1基因同时敲除的U2OS细胞，结果发现ASK1参与了p38的第一次激活反应，而ZAKα是第二次激活反应不可缺少的激酶，并仅参与第二次激活反应 (图3B)，这表明ASK1对氧化应激的反应更快，并且ROS在RSR激活之前已经对大分子和核糖体造成了损伤。研究人员用过氧化氢刺激U2OS细胞，发现抑制ZAK和ASK1激酶的活性进一步会抑制MAPK激活(图S3G)。以上结果表明，ROS可以激活ASK1，并且ZAKα能够将ROS诱导的翻译损伤传递给MAPK信号（图3C）。
图3. ZAKα介导的甲萘醌诱导的斑马鱼细胞凋亡和死亡
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ZAKα介导ROS诱导的斑马鱼幼体死亡
为了探究 ROS 诱导的 RSR 信号对生物体的影响，研究人员使用斑马鱼来进行后续实验。哺乳动物含有一个 Zak基因，该基因编码两种不同的剪接变体（图1C），而在斑马鱼体内，ZAKα和ZAKβ作为两个独立基因，可以同时表达（图S3H）。研究人员构建了斑马鱼ZAKα、ZAKβ单独敲除和共敲除的KO模型（图3E和图 S3I）
研究人员将受精的野生型(WT)斑马鱼卵暴露于甲萘醌中，发现大多数幼体在3-4天后因心脏骤停而死亡(图3F, G)，并且会出现卵黄囊和心脏水肿、脊柱和尾巴弯曲和长度缩短等畸形表型(图3H)。然而，在培养水中同时添加 NAC 可消除这些影响，因此研究人员推测，出现这些症状的原因在于病理性ROS的产生。虽然zakβ-/-处理组对甲萘醌同样敏感，但zakα-/-和共同敲除组幼体对死亡和病理表型具有较强的抵抗力(图3G, H)。甲萘醌诱导的病理变化与细胞凋亡有关，而添加NAC或敲除zakα也可以消除这种变化（图3I）。综上所述，生物体内的ZAKα能够对ROS作出反应，zakα-/-斑马鱼幼体能够在短期内，免受病理性ROS爆发的有害影响。
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ZAK-/-小鼠能抵抗高热量饮食诱导的代谢功能障碍
研究人员发现，人体不同组织中ZAKα和ASK1转录本的相对表达水平各不相同，其中肝脏中的ASK1 mRNA相对较少，同时肝脏也是ZAKα的表达量超过ZAKβ的极少数组织之一（图S3J）。对小鼠蛋白质组分析也表明，包括肝脏在内的几个代谢器官中，ZAKα蛋白表达水平均高于ASK1（图S3K）。研究人员给小鼠喂食了25周的高脂高糖饲料（HFHS），中间只进行腹腔葡萄糖耐量试验（ipGTT）和磁共振（MR）扫描以确定体成分（图4A）。雄性ZAK-/-小鼠的初始体重略低于雄性WT小鼠（图S4A）。当ZAK-/-小鼠从正常饮食转为 HFHS饮食时，一开始体重增加得较为缓慢，但之后两种基因型小鼠的体重增加情况基本一致（图4B），并且在整个实验过程中两种小鼠的摄食量基本相同（图 S4B）。核磁共振扫描显示，WT小鼠的脂肪含量显著增加（图S4C），而ZAK-/-小鼠的脂肪含量显著低于WT小鼠（图S4C），并且在整个实验过程中，两种小鼠的瘦肉含量都相对恒定（图S4D）。ipGTT结果显示，HFHS饮食使WT小鼠在第8周出现了明显的血糖调节紊乱，在19周时紊乱加剧（图4C），而ZAK敲除能够改善这种功能性的代谢衰退，在第8周时，ZAK-/-小鼠的 ipGTT结果与正常饮食的小鼠相似（图 4C上, 中）。在第19周时，ZAK-/-小鼠出现了一定程度的葡萄糖不耐受，但相对而言WT小鼠的情况较为严重（图4C下）。与此相一致，与WT小鼠相比，ZAK-/-小鼠在第19周胰岛素抵抗改善，HOMA-IR（胰岛素抵抗静态模型评估）值降低了 50%（图4D, 图S4E, F）。在进行HFHS饮食第8周后，WT小鼠与ZAK-/-小鼠间的胰岛素敏感性无显著差异（图 4E）。25周后研究人员对小鼠进行了安乐死处理，发现WT和 ZAK-/- 小鼠的肝脏重量无差异（图S4G），但HFHS饮食的ZAK-/-小鼠肝脏甘油三酯水平比WT小鼠低50%，但二者的血清甘油三酯水平无明显差异（图4F, 图 S4H），并且与WT组相比，ZAK-/-小鼠肝脏的脂肪变性等级较低（图4G, H）。以上结果表明，ZAK敲除能够在早期避免小鼠出现饮食诱导的葡萄糖不耐受，减少肝脏脂肪变性，而WT小鼠与ZAK-/-小鼠在第8周时的全身胰岛素敏感性相似，为了探究ZAK敲除改善代谢的机制，研究人员对WT和ZAK-/-小鼠饲喂HFHS饲料10周，并用2-脱氧葡萄糖(2DG)进行葡萄糖示踪实验，注射药物使小鼠安乐死后，测定多个中枢和外周组织对放射性葡萄糖的摄取（图 S4I）。结果显示，两种基因型小鼠对2DG的摄取以及在终点转化为 2DG-6-phosphate (2DG6P) 的速度相似（图S4J），但ZAK-/-小鼠的血液中放射性葡萄糖的清除速度更快（图S4J左上），但60 min后WT和ZAK-/-小鼠各组织摄取葡萄糖的能力相同。接下来，研究人员将喂食正常饲料和HFHS饲料6 周的WT和ZAK-/-小鼠放入代谢笼1周，并监测运动、氧气消耗和二氧化碳产生情况（图S5A），结果显示，运动与能量消耗情况在两组之间没有差异（图S5B-D），但喂食正常饲料的ZAK-/-小鼠的呼吸交换比率显著高于WT小鼠（图S5E-G），说明相比于脂类而言，ZAK-/-小鼠更倾向于利用碳水化合物作为能量来源，但这种情况只有在喂食正常饲料的小鼠中才能观察到。
为了探究ROS对ZAK KO相关代谢表型的影响，研究人员在喂食HFHS饲料的同时，在饮用水中添加了NAC。在第5周和第10周时进行 ipGTT试验，12周后对小鼠实施安乐死（图S6A）。在该实验中，ZAK-/-小鼠的体重增加，而高剂量的NAC抑制了体重的增加（图S6B）。ipGTT实验结果显示，WT小鼠逐渐出现葡萄糖不耐受，HOMA-IR升高；而 ZAK-/-小鼠在饲喂HFHS第5周和第10周后没有出现明显的葡萄糖不耐受情况（图S6C-G）。补充NAC之后，WT小鼠的血糖水平（图S6C, D）、空腹胰岛素水平（图S6F）和 HOMA-IR （图S6G）都与ZAK敲除小鼠的表型类似，但补充NAC只能部分改善WT小鼠的肝脏脂肪变性情况，不能达到与ZAK KO同等的保护效果（图S6H, I）。综合上述结果表明，由 ROS 和其他核糖体损伤源激活的 RSR 信号在某些方面介导了促进了代谢的紊乱。
图4. ZAK-/-小鼠可以避免与肥胖相关的代谢功能障碍
附图4. WT和ZAK-/-小鼠饲喂高脂高糖饮食后的体成分和葡萄糖摄取
附图5. 代谢笼研究表明，ZAK-/-小鼠的呼吸交换率增强
附图6. 补充NAC会影响ZAK基因敲除对葡萄糖耐量的影响，但不会影响肝脏脂肪变性
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磷酸化蛋白质组学分析揭示饲喂HFHS的ZAK-/-小鼠肝脏中MAPK信号通路失调
研究人员利用磷酸化蛋白质组学分析了HFHS喂养5周的小鼠肝脏中p38 和 JNK 激酶的信号转导情况，并在肝脏ROS水平最高的灭灯阶段将小鼠安乐死（小编注：有研究发现肝脏ROS水平具有节律效应，与光照阶段（Light Phase）相比，灭灯阶段（Dark phase）具有更高的ROS水平。Pei JF, Li XK, etc. Diurnal oscillations of endogenous H2O2 sustained by p66Shc regulate circadian clocks. Nat Cell Biol. 2019）（图 5A），研究人员鉴定出了 5500 个独特的蛋白和12500个独特的磷酸化位点（表S1和S2）。主成分分析（PCA）显示，样本在蛋白质水平上几乎没有差异（图S7A），但在磷酸化位点水平上，不同基因型和饮食的小鼠样本出现了明显的分离和聚类（图5B）。研究人员利用该数据集研究了所有记录的MAPK、MAP2K和MAP3K成分磷酸化的调控变化（图S7B），揭示了HFHS和Zak对p38和JNK信号转导级联反应中几个组分与磷酸化位点活化相关的依赖性调控。研究人员对所有条件下的相关磷酸化蛋白进行更精细的分析后发现，在HFHS饲养的ZAK-/-小鼠中，JNK2（MAPK9-Y185）的磷酸化水平减少（图5C、图S7C、表S2）。然而，研究人员对相同的肝脏样本进行了WB检测，发现ZAK-/-小鼠中HFHS 诱导的 JNK 磷酸化并没有显著减少（图5D）。在WT小鼠中，HFHS诱导的RSR信号转导有一部分可能发生在肝脏脂肪变性的细胞中，通过免疫组化 (IHC) 检测到其中p-JNK呈弱阳性（图S7D）。此外，研究人员用普通饲料和HFHS 饲料喂养WT和ZAK-/-小鼠16周，禁食一夜后对小鼠实施安乐死，通过Western blot分析肝脏中的p-JNK（图S7E），通过这种方法也未能检测出HFHS相关的JNK 活性的失调，这可能是由于样本量小而导致的（图S7F）。
图5. 对单体和双体足迹进行的核糖体图谱分析表明，喂食 HFHS 后，翻译发生了不同程度的变化
附图7. 小鼠肝脏蛋白质组学分析
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肝脏核糖体分析揭示了HFHS处理对高表达转录本的全局翻译和不同停滞和碰撞位点的影响
为了探究HFHS饮食对肝脏中翻译水平的影响，研究人员进行了核糖体图谱分析（Ribo-seq）（图5E），并从两种足迹类型中制备了核糖体序列文库：标准的~30 nt单体保护足迹和~60 nt二体足迹，后者代表了核糖体的堆积和碰撞。即使在生理条件下，也能在小鼠肝脏的特定位置观察到丰富的二体足迹，这可能是暂时性翻译减慢的部位，不会引发以RSR为代表的碰撞反应。为了进一步识别HFHS依赖性加剧的二体覆盖位点或新位点，研究人员首先对前500个表达基因的足迹信号进行主成分分析，按照文库类型（单体或二体）与饮食（正常饮食或HFHS）进行分离（图5F）。单体足迹分析表明，HFHS饮食对延伸动力学没有显示出很强的系统性和转录组范围的影响，通过比对编码序列5′和3′末端的足迹（图S8A）和密码子的停留时间也证明了这一点（图S8B）。进一步，研究人员使用最近报道的暂停得分指标计算了整个转录组范围内特定位置的核糖体占据率，结果显示，与普通饲料喂养的小鼠相比，HFHS喂养小鼠的核糖体中，有150个位点的相对占用率增加，160个位点的相对占用率减少 (图S8C左)，其中许多位点位于翻译组上核糖体占据率较高的位置（图S8C右）。因此作者探讨了一种可能性，即与HFHS 处理有关的翻译改变主要影响转录本上具有高翻译通量的少数位点。因此，研究人员量化了单个高表达基因对肝脏中翻译的贡献，结果显示，肝脏的翻译过程强烈偏向于少数几个占主导地位的转录本，尤其是编码血液分泌蛋白的 mRNA，如白蛋白（Alb，占肝脏翻译总量的8.9%）、载脂蛋白E（Apoe，占4.2%）和其他 mRNA（图5G深灰色曲线；119 个基因占肝脏翻译总量的 50%）。二体足迹的分布与此大致相同（图5G浅灰色曲线）。差异密码子位点组更偏向于高度显性转录本，Alb、Apoe和Tfr这三种 mRNA 占已检测到的位点的一半（图5G橙色曲线, 表S3）。为了跟进这一结果，研究人员检测了单体和二体的覆盖范围以及排名靠前的转录本的不同密码子位点，结果表明，HFHS和普通饲料喂养小鼠的总体足迹分布高度相似且具有可重复性，例如Alb mRNA的单体和双体覆盖模式（图S8D）。然而，对于一些含量很高的mRNA，如Apoe（图5H）和Rbp4（视黄醇结合蛋白4）（图5I），与对照组相比， HFHS 动物肝脏中出现了强烈富集的二体位点（图 5H, I橙色阴影和箭头），这些二体位点位于上游，与单体足迹几率分析中增加的差异位点非常接近，这与这些位点的碰撞增加相一致（图5J -L）。
附图8. 小鼠肝脏单体和二体足迹的核糖体分析
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ZAK-/-小鼠在衰老过程中可以免受代谢下降的影响
雄性小鼠在衰老过程中会出现胰岛素抵抗，而这种抵抗在小鼠老年时可通过胰岛肥大来代偿。由于ZAK敲除能够避免小鼠出现肥胖代谢功能障碍，研究人员用普通饲料喂养WT和ZAK-/-小鼠，待小鼠生长至14-16月龄后，进行ipGTT实验（图6A）。与年轻小鼠类似，此时WT雄性小鼠的体重略高于ZAK-/-雄性小鼠（图S8E），而敲除ZAK并不会对雌性小鼠的体重产生影响（图S8F）。在ipGTT试验中，衰老雄性WT小鼠的血糖调节能力严重受损（图6B上图），而衰老ZAK-/-雄性小鼠的血糖调节能力与年轻雄性小鼠没有差异（图4C上图, 图 6B 上图），衰老ZAK-/-雌性小鼠的代谢表型与WT小鼠没有差异（图6B下图）。研究人员检测了衰老雄性小鼠的空腹血糖水平、胰岛素水平和HOMA-IR值，发现与WT小鼠相比，衰老ZAK-/-雄性小鼠这些指标都显著降低，进一步说明了ZAK敲除能够改善雄性小鼠由于衰老引起的血糖紊乱（图6C -E）。与早期（第8周）HFHS诱导的肥胖相似（图4C-E），研究人员对WT和ZAK-/-雄性小鼠进行了ipITT实验，证明了雄性小鼠发生的上述一系列变化是在全身胰岛素敏感性没有明显差异的前提下发生的（图S8G）。对这些小鼠肝脏的进行检测，结果表明，7只WT小鼠中有3只出现了不同程度的肝脏脂肪变性，而6只ZAK-/-小鼠中只有1只出现了轻微的代谢性疾病（图6F, G）。
这些结果表明，在肥胖和衰老过程中，潜在的代谢应激信号是重叠的，但是程度和持续的时间有所不同。为了比较肥胖和衰老过程中，肝脏的氧化应激负担程度，研究人员检测了年轻WT小鼠、衰老WT小鼠、普通饲料喂养的WT小鼠和HFHS喂养的WT小鼠肝脏中4-HNE的含量（4-HNE是一种常用的脂质过氧化标记物，用于诊断NASH和其他与氧化应激相关的疾病）。IHC染色结果显示，用普通饲料喂养的年轻小鼠肝脏的背景染色均匀，着色较浅（图S9A），但对图4A中HFHS喂养小鼠的整体着色明显增加，门静脉周围区域脂肪变性明显（图 S9B），而在衰老小鼠的肝脏中没有观察到这些现象（图 S9C），表明衰老小鼠的肝脏中氧化应激负荷虽然有所增加，但程度低于HFHS饲养的小鼠。
图6. 衰老雄性ZAK-/-小鼠的代谢情况
附图9. HFHS饲养的小鼠的肝脏含有大量的ROS标志物4-HNE
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ZAK-/-小鼠棕色脂肪组织结构和功能退化减弱
雄性小鼠和人类的脂肪组织都会因衰老而退化。与衰老WT小鼠的BAT切片相比，衰老ZAK-/-小鼠的染色强度接近于年轻小鼠的BAT（图S10A上，中，图S11A）。与年轻WT小鼠相比，衰老小鼠中BAT脂滴更大（图6H, I），并且与ZAK-/-小鼠相比，WT小鼠的脂滴变化趋势更为明显。研究人员检测接受HFHS喂养小鼠25周的BAT样本时，发现ZAK敲除能够起到类似于阻止BAT白色化的作用（图4A，图S10下，图 S11A, B）。研究人员对剃毛小鼠肩胛间BAT的红外成像来检测功能性产热，结果显示，虽然喂养HFHS会导致BAT 温度降低，从而影响WT小鼠的产热，但ZAK-/-小鼠的BAT仍然保持了较高温度（图S11C, D）。
附图10. 衰老与肥胖小鼠中棕色脂肪组织结构分析
附图11. 棕色脂肪组织在肥胖小鼠中的功能
总结
综上所述，肥胖和衰老引起体内ROS增加，从而促进翻译损伤和RSR过程，最终导致代谢失调。而敲除Zak基因则能通过抑制p38 和 JNK 激酶的激活来改善肥胖和衰老引起的代谢失调，该研究为ZAKα激酶作为治疗非酒精性脂肪性肝炎、高血压和血脂异常等代谢性疾病的潜在药物靶点提供了理论基础。
原文链接：https://doi:10.1126/science.aau6977
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