校对 | 于剑
背景介绍
脂肪细胞能够通过多种途径消耗机体储存的能量同时通过线粒体氧化产生热量，因此脂肪细胞的代谢活动与机体代谢健康密切相关。机体的大部分组织器官都能够进行代谢产热，而其中棕色脂肪组织是产热能力最强的部位，大约可提供非颤抖产热总量的70%，因此棕色脂肪组织对动物在寒冷环境中维持体温至关重要。线粒体是细胞进行能量代谢的重要器官，线粒体中的呼吸链蛋白将质子泵入线粒体内外膜间隙，形成蕴含着大量电化学势能的质子梯度，接下来ATP合成酶利用质子梯度储存的电化学势能来合成ATP，这种将电子传递和ATP形成相偶联的机制称为氧化磷酸化，当机体受到冷刺激和β-肾上腺素能受体激动剂激活时，棕色脂肪组织中的Ucp1将质子回流和ATP合成解偶联，使质子梯度的势能以热能的形式释放，从而促进机体产热。近年来，研究人员发现棕色脂肪中还存在多种Ucp1非依赖性产热途径，这些途径也能够参与调节全身能量稳态，例如研究发现肌浆/内质网钙ATP酶(Sarcoplasmic/ endoplasmic reticulum Ca2+ ATPase，SERCA)摄取Ca2+进入内质网，同时兰尼碱受体2(Ryanodine receptor 2, RYR2)介导Ca2+从内质网外流，这一过程与SERCA水解ATP相偶联，进而产生热量。也有研究发现在肌酸循环的过程中也会释放热能，肌酸循环即在酶的催化作用下，细胞内发生连续的肌酸磷酸化和去磷酸化，从而消散高能磷酸键的能量，并释放大量热量的循环反应。在反应进程中肌酸激酶将ATP上的高能磷酸键转移至肌酸生成磷酸肌酸和ADP，然后磷酸酶将磷酸肌酸水解生成磷酸和肌酸，同时将释放的能量转换为热能。但目前对于非依赖性Ucp1产热途径的研究主要集中在种系Ucp1敲除小鼠(Ucp1-/-小鼠)中，虽然种系Ucp1-/-小鼠模型推进了有关脂肪细胞产热的研究，但种系Ucp1-/-小鼠的BAT中存在Ucp1缺失外的其他变化，例如氧化磷酸化复合物表达水平降低和线粒体完整性的破坏，这些变化可能会减弱任何产热途径的产热能力。此外，由于种系Ucp1-/-小鼠在BAT和全身表现出严重的免疫紊乱，无法正常产热，因此有研究人员认为此时用以维持小鼠产热的Ucp1非依赖性产热机制可能在BAT之外被大幅上调。
目前虽然已经在脂肪细胞内部发现存在着钙循环、肌酸循环等多种Ucp1非依赖性产热途径，然而这些途径是否能够在脂肪细胞内部与Ucp1相互调控尚不清楚，为了解答这一问题，麦吉尔大学Lawrence Kazak团队进行相关研究，其成果“Parallel control of cold-triggered adipocyte thermogenesis by UCP1 and CKB”近期发表在Cell Metabolism，该研究发现在棕色脂肪细胞中存在UCP1和CKB两种途径平行调控产热，即棕色脂肪细胞产热并不完全依赖于UCP1。
1、F1杂交种系Ucp1-/-小鼠会发生继发性变化
2、脂肪细胞产热并不完全依赖于UCP1
3、UCP1和CKB能够介导寒冷刺激下的平行产热
4、寒冷刺激下棕色脂肪中会再生UCP1和CKB
研究结果
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小鼠发生继发性变化近交系(129S1/SvImJ或C57BL/6J)Ucp1-/-小鼠表现出明显的寒冷不耐受，而杂交系(129S1/SvImJ x C57BL/6J)Ucp1-/-小鼠具有耐寒性。中度寒冷刺激条件下(8-10周龄，15℃冷暴露14天)，与各自同窝Ucp1-/+小鼠相比，近交系Ucp1-/-小鼠(雌鼠和雄鼠)和杂交系Ucp1-/-小鼠(雌鼠和雄鼠)的BAT中呼吸链蛋白NADH:泛醌氧化还原酶B8亚基(NADH:Ubiquinone Oxidoreductase Subunit B8, NDUFB8)、琥珀酸脱氢酶B亚基(Succinate Dehydrogenase Complex Subunit B, SDHB)和线粒体细胞色素c氧化酶Ⅰ(Mitochondrial Cytochrome C Oxidase Ⅰ, MTCOI)表达水平均显著降低(图1A-D)(小编注：NDUFB8、SDHB和MTCOI分别是线粒体复合物I、II和IV的亚基)。并且与在热中性环境(30℃，3周)相比，近交系Ucp1-/-小鼠和杂交系Ucp1-/-小鼠在中度寒冷环境下(15°C，2周)呼吸链蛋白的下降幅度均更加明显 (图S1A-D)。定量蛋白组学能更广泛的检测所有电子传递链蛋白，研究人员使用定量蛋白组学研究发现在30℃环境下，近交系Ucp1-/-小鼠和杂交系Ucp1-/-小鼠BAT中电子传递链蛋白均减少。这些研究表明，杂交系Ucp1-/-小鼠的耐寒性与BAT中电子传递链无关。此外，研究人员发现在中度寒冷刺激下，近交系Ucp1-/-小鼠和杂交系Ucp1-/-小鼠的肌酸激酶b(Creatine Kinase B, CKB)和组织非特异性碱性磷酸酶(Tissue Non-Specific Alkaline Phosphatase, TNAP)蛋白水平均高于对照(Ucp1-/+)小鼠(图1E-H)。而在热中性条件下，近交系Ucp1-/-小鼠和杂交系Ucp1-/-小鼠的CKB和TNAP没有代偿性升高(图S1E-H)。这些数据表明，在多个品系的小鼠中敲除Ucp1会诱导肌酸无效循环的效应物水平上调，然而杂交系Ucp1-/-小鼠的BAT会表现出电子传递链蛋白减少等继发性变化，这些变化对产热具有影响，继续使用该模型研究BAT内Ucp1依赖性和非依赖性产热途径存在弊端。因此，研究人员采用了其他策略进行进一步研究。
图1.诱导性UCP1敲除
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图2.诱导性UCP1敲除，无继发性变化
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为了探究UCP1对脂肪细胞产热的贡献，研究人员首先测量了棕色脂肪细胞固有的产热反应，研究人员从Ucp1-/-小鼠中分离出棕色脂肪细胞，而后在30℃环境培养7天，结果发现与Ucp1+/+棕色脂肪细胞相比Ucp1-/-棕色脂肪细胞由肾上腺素驱动的产热功能显著受损(图3A)。相比之下，Ucp1iBKO棕色脂肪细胞表现出与Ucp1fl/fl和Ucp1+/+棕色脂肪细胞相同的产热能力(图3A)，同时各组间的基础呼吸没有差异(图S2A)。在Ucp1-/-棕色脂肪细胞中缺乏NA驱动的产热反应，而在Ucp1iBKO棕色脂肪细胞中存在该反应，这表明在Ucp1-/-棕色脂肪细胞中UCP1非依赖性产热反应受损。与此同时，研究人员发现与Ucp1+/+对照小鼠相比，种系Ucp1-/-小鼠BAT中的α-肾上腺素能受体(alpha-adrenergic receptor, Adra1a)表达水平显著降低，但在Ucp1iBKO小鼠的BAT中未发生类似变化(图3B)。已有文献表明ADRA1A信号通路能够促进NA驱动的UCP1非依赖性产热，ADRA1A(使用1μM的ADRA1A激动剂A61603)的激动作用能够增强cAMP(forskolin：cAMP激动剂)介导的呼吸反应，这种反应在Ucp1+/+，Ucp1fl/fl和Ucp1iBKO棕色脂肪细胞中相似，但不存在于Ucp1-/-棕色脂肪细胞中(图3C)。这些数据与上述脂解研究相结合，能够说明从出生起就缺乏UCP1的产热脂肪细胞参与代谢燃料输送相关上游信号的能力降低，从而进一步减弱了产热输出。更重要的是，ADRA1A传导的产热过程80%-90%由CKB和TNAP介导，因此在Ucp1-/-产热脂肪急性分离的棕色脂肪细胞中，CKB和TNAP介导的UCP1非依赖性产热过程受到损害。
由于BAT介导的能量消耗对于机体在寒冷环境下维持体温至关重要，接下来研究人员检测了急性寒冷刺激后小鼠直肠温度的变化。研究人员将小鼠从30℃转移到5℃环境2.5小时，种系Ucp1-/-小鼠体温显著降低(对照组Ucp1+/+小鼠)，而Ucp1iBKO小鼠(对照组Ucp1fl/fl)的体温仅略微降低并相对恒定(图3D)，因此出生时缺乏Ucp1的小鼠相对于其同窝对照小鼠表现出寒冷不耐受，这种表型比成年后诱导Ucp1缺失的小鼠更为严重。研究人员还发现种系Ucp1-/-小鼠虽然体温下降，但其与同窝对照的能量消耗相似，因此种系Ucp1-/-小鼠在寒冷环境中的较低体温并不是全身代谢产热受损的结果，(图S2B)且种系Ucp1-/-小鼠（寒冷不耐受）、Ucp1+/+小鼠、Ucp1iBKO（耐寒）、Ucp1fl/fl在寒冷刺激下的能量消耗最终能够达到相似的水平。在先前的研究中，研究人员通过间接热量法测量发现在5℃时若小鼠（小编注：作者发现本实验中所有基因型的C57小鼠都符合这个规律，所以作者在后续检测中以0.2kcal/h为分界线进行分组）的能量消耗降至0.2kcal/h，此时直肠温度为28℃或更低，这与小鼠仍然能够在寒冷中存活相矛盾，因此，研究人员以高或低于0.2kcal/h的能量消耗水平进行初步分组，用以区分寒冷不耐受小鼠与耐寒小鼠。为了避免手术体温计植入或使用直肠探针干扰产热输出，研究人员选择非侵入性方法（小编注：作者使用代谢笼进行EE检测来作为体温下降的指标。作者在先前发现EE低于0.2kcal/h时小鼠出现失温症状(低于28℃)，通过这种方式可防止肛温侵入式检测对小鼠的影响）测量小鼠体温，发现所有Ucp1-/-小鼠在寒冷环境下都表现出体温降低的寒冷不耐受状况(图3E、F)，而大多数Ucp1iBKO小鼠具有耐寒性(图3E、F)。耐寒的Ucp1iBKO小鼠与Ucp1+/+和Ucp1fl/fl小鼠相比，能量消耗没有差异(图S2C、D)，表明不同基因型间的“产热耗能比”相似。为了进一步探究热量守恒，研究人员绘制了从热中性到亚热中性的一系列环境温度变化与能量消耗的关系图(Scholander图)，Scholander曲线的斜率反映了热量守恒的程度。不同基因型的同性别鼠体重相似(图S2E、F)，且虽然随着环境温度的降低，小鼠能量消耗增加，但不同基因型的Scholander曲线(能量消耗)始终没有出现显著差异(图3G、H)，这些数据排除了热量守恒能够维持Ucp1iBKO小鼠体温的观点。研究人员也发现Ucp1iBKO小鼠残留的UCP1与小鼠在寒冷中维持体温的能力不存在相关性(图S2G、H)，这说明BAT中残留的UCP1不能充分解释Ucp1iBKO小鼠的耐寒表型。总体而言，这些结果表明UCP1对于脂肪细胞内在产热和维持寒冷环境下的体温并非不可或缺的，随后研究人员探究了其生理学相关性。
图3.种系和诱导性Ucp1敲除间不同的产热输出
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图4.通过UCP1和CKB平行调控寒冷环境诱导的产热
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骨骼肌中的钙循环产热由肌浆网钙Ca2+ATP酶(sarcoplasmic/ endoplasmic reticulum Ca2+ ATPase，SERCA)介导Ca2+进入肌肉内质网腔内和兰尼碱受体 1(Ryanodine receptor 1, RYR1)介导的Ca2+泄漏两个部分相协调完成。然而，研究人员发现在所有基因型小鼠的红腓肠肌(图4H-M)或比目鱼肌(图S3D-G)中，钙摄取、SERCA活性和SERCA偶联效率均未发生变化。这表明骨骼肌非战栗性产热功能受损与iADKO小鼠的寒冷不耐受表型无关。此外，研究人员未在脂肪细胞缺乏Ucp1(Ucp1iAKO)、Ckb(CkbiAKO)或同时缺乏两种基因(iADKO)的小鼠中发现骨骼肌非战栗性产热代偿性升高的证据。
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为了进一步了解BAT内CKB和UCP1蛋白水平何时得到恢复，研究人员在中等寒冷环境中的不同时间点检测了CKB和UCP1蛋白表达水平(图6A)。结果发现与对照Ucp1flfl;Ckbfl/fl小鼠相比，在30℃下iADKO小鼠BAT中的CKB和UCP1蛋白水平降低，并在15℃下饲养4天后仍显著降低。然而在15℃饲养8天后，CKB和UCP1在雌雄小鼠中重现(图6B、C)，但在30℃饲养相同时间小鼠BAT中两种蛋白并未重新出现(图S5A)。除此之外，研究人员发现在30℃下iADKO小鼠的BAT重量高于对照小鼠，而在15℃饲养4天后显著增加，在15℃饲养8天后恢复到对照水平（小编注：此处图中说明在15℃饲养4天后，与对照Ucp1flfl;Ckbfl/fl小鼠相比，iADKO小鼠的BAT重量显著增加，作者认为在此期间iADKO小鼠BAT中脂质含量升高，从而导致BAT变重，在15℃饲养8天后iADKO小鼠BAT中的脂质含量大幅降低，因此iADKO小鼠BAT的重量也降低至对照水平）(图6D)，基于此，研究人员在这些时间点对BAT进行组织学分析，发现在30℃时不同基因型间的脂质含量没有明显差异(图6E)。在15℃下饲养4天后Ucp1flfl;Ckbfl/fl小鼠BAT中脂质含量减少，而iADKO小鼠BAT中脂质含量仍然升高，然而在15℃饲养8天后，iADKO小鼠BAT中的脂质含量大幅降低至对照水平(图6F)。通过WB实验，研究人员发现这是组织中CKB完全恢复和UCP1部分恢复的时间点(图6B、C)。这些发现表明，再生的CKB和UCP1的协同产热活动抑制了iADKO棕色脂肪细胞中的脂质积累，处在寒冷环境下的iADKO小鼠BAT中CKB和UCP1恢复的动力学表明，CKB蛋白的表达早于UCP1，并在棕色脂肪形成的早期阶段发挥更大的产热作用。然而这些推测仍需进一步验证。
图5.通过寒冷刺激的棕色脂肪从头生成协调恢复UCP1和CKB
图6.UCP1和CKB寒冷恢复的时间过程
图S4.Alpl mRNA水平
图S5.处于热中性的UCP1和CKB
图S6.肌肉和BAT中UCP1非依赖性产热基因的表达
总结
原文链接：https://www.cell.com/cell-metabolism/fulltext/S1550-4131(24)00001-9
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