益生菌是活的微生物，如果剂量充足，对健康有益。据报道，益生菌通过修饰肠道微生物群、产生代谢实体、中和膳食致癌物、调节免疫系统和控制病原体，为宿主提供有益功能。它们已成为商业食品、膳食补充剂和药物制剂的有吸引力的候选者。特别是嗜酸乳杆菌 (La)，一种被美国食品药品监督管理局 认为安全的乳酸菌。口服给药时，它有多种好处，例如控制胃和阴道感染、预防和治疗消化系统疾病、刺激免疫系统以及改善皮肤健康。
本文受骨矿化过程启发，通过一步法将La掺入矿化胶原蛋白基质(散装封装)中。胶原蛋白原纤维在益生菌存在下同时自组装和矿化，从而产生杂交活性物质 (mCol@La)。La的特定胶原蛋白结合和粘附特性确保生物体有效整合到基于胶原蛋白的基质中。同时，益生菌涂有一层纳米结构矿物膜(单细胞封装)，为生物体提供额外的保护。这种双重封装增强了益生菌的活力，增强了它们的活性，并避免了它们从基质中泄漏。此外,HLM中益生菌的稳定性和代谢活性的提高使牛奶能够发酵，从而产生酸奶。这些酸奶对铜绿假单胞菌(Pa)和金黄色葡萄球菌(Sa)这两种广泛分布的食源性病原体具有抗菌活性。
图1. 基于益生菌的HLM的合成和表征。
将益生菌掺入矿化胶原纤维的致密基质中，产生HLM。将La添加到含有钙离子和I 型胶原蛋白单体的酸性溶液中。随后，加入含有磷酸盐、柠檬酸盐和碳酸根离子的碱性溶液，后两者是骨纳米磷灰石的重要成分，导致胶原纤维同时自组装和矿化，从而产生一种称为mCol@La。mCol@La 的扫描电子显微镜(SEM)图像显示胶原蛋白自组装成高密度矿化纤维基质，具有其特有的D带图案。益生菌被困在这种基质中。矿物相覆盖细菌和胶原纤维，通过带有背散射电子的SEM进一步证实了La整合到矿化胶原蛋白基质中（图1）。
图2.mCol@La的理化性质。
胶原纤维的高倍电镜图像证实了磷灰石晶体在纤维内的定位，纳米级血小板的晶体学c轴，平行于原纤维的长轴。胶原纤维中矿物的选择面积电子衍射显示为无定形，这是由于胶原纤维的漫射散射和低矿物质密度，而胶原纤维外矿物聚落的SAED显示羟基磷灰石在d间距为3.44和2.75Å处的典型反射002和112。在存在益生菌和不存在益生菌的情况下，胶原原纤维的纤维间和纤维内矿化都通过这种仿生方法发生，两者之间没有显著差异。非生物复合材料mCol的EDS元素图也显示了钙和磷在胶原纤维中的分布，揭示了沿着胶原原纤维排列的矿物纳米晶体（图2）。
图3. HLMs的CLSM图像和。
共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）图像显示，在mCol@La， m@La和Col@La中，活的益生菌（绿色）和少量的死菌（红色）。因此，胶原蛋白和/或矿物质的存在不影响细菌的生存能力。这些图像也与SEM显微照片一致：细菌倾向于在胶原蛋白存在的情况下形成大的聚集体，而不管矿物质是否存在，可能是由于益生菌和胶原纤维之间的特定相互作用（图3）。
图4.模拟胃环境下的益生菌活力。
新型口腔保健材料最相关的参数之一是它们抵抗胃部恶劣、酸性环境的能力。这对于包括益生菌在内的生物材料尤其相关，它们必须在这些条件下生存。通过在模拟胃液(SGF)中孵育2小时mCol@La、Col@La和 m@La前后的平板计数来评估益生菌的存活率。惰性胶原蛋白基质为La生物膜的形成提供了最佳底物。益生菌的特定胶原蛋白结合和粘附特性确保它们有效地整合到基于胶原蛋白的基质中，从而促进它们的定植和生物膜形成（图4）。
图5.用 HLM 生产的益生菌酸奶的抗菌活性。
HLMs产生的酸奶的抑制活性最初在针对Pa和Sa的琼脂扩散测定中进行了测试（图 5）。需要强调的是，病原体是在TSA中培养的，TSA是一种最适合病原体生长但对益生菌不利的培养基。尽管如此，所有HLM酸奶都显示出对两种病原体的抑制光晕。在Pa的抑制光晕周围可以看到绿色调，这归因于细菌本身产生的绿脓素色素，它增强了Pa的毒力因子。与非生产菌株相比，产生绿脓菌素的菌株表现出更高的毒力和耐药性。这些结果表明，HLM 生产的酸奶在病原体生长的最佳培养基中具有抗菌活性，更接近现实生活条件（图5）。
在这项研究中，合成并详细表征了一种含有La的HLM，La是一种广泛用于获得发酵乳制品的益生菌，已知口服时会产生多种益处。这些HML被掺入具有骨纳米结构特征的矿化基质中。合成方法产生了自组装胶原纤维的原纤维内和原纤维外矿化，类似于在骨骼中观察到的。HLM为益生菌提供双重保护。一方面，益生菌被整合和保护的增强有机/无机支架。另一方面，纤维外矿化导致益生菌的单细胞包封。此外，这些HLM有助于生产能够抑制病原菌生长的酸奶，包括Pa和Sa，这些细菌是最普遍的食源性细菌，会导致脑膜炎、尿路感染、肺炎和胃肠炎等严重感染。值得注意的是，矿化支架内的益生菌在模拟胃液环境中表现出弹性，这可能会提高口服给药时的疗效。本文描述的生产HLM的方法可以扩展到掺入其他类型的益生菌，从而促进具有增强功能的多样化材料的开发，适用于广泛的生物医学应用。
近期，该研究成果以“Probiotic‐Based Mineralized Living Materials to Produce Antimicrobial Yogurts”为题发表于学术期刊《Advanced Healthcare Materials》，论文第一作者为Gloria B. Ramírez‐Rodríguez，通讯作者为格拉纳达大学José M. Delgado‐López
撰稿人：王 晟
审稿人：佘 雨
论文全文链接
https://doi.org/10.1002/adhm.202402793
抗菌抗污材料前沿
长按二维码关注
获取最新科研消息
