食源性疾病（FBD）在全球范围内是一个重大的公共卫生问题，导致各国出现病患和死亡，并阻碍了经济的发展。通常，FBD是由于在食品生产、加工、运输和储存过程中受到细菌如金黄色葡萄球菌和大肠杆菌O157:H7的污染所致。为了解决微生物污染问题，食品行业通常采用苯甲酸、丙酸和亚硝酸盐等化学防腐剂。然而，随着消费者对食品安全的担忧日益增加，科学界越来越关注寻找安全有效的天然抗菌剂。
本研究旨在从香精油提取后剩余的香料残渣中合成碳量子点（CQDs），评估其乳化效能，并将其与采用聚山梨酯-80（Tween-80）作为表面活性剂的传统乳液的抗菌性能进行比较。使用超纯蒸馏水和乙醇制备了四种类型的CQDs，并通过1H NMR、XPS和界面张力分析证明用40%乙醇制备的CQDs是最有效的乳化剂。此外，CQDs的独特性质使得皮克林乳液的表面相对粗糙，这增强了其与细菌的相互作用，并通过破坏细胞膜显示出强大的抗菌效果。
图1.以40%乙醇合成的CQDs的高分辨率透射电子显微镜（TEM）图像。
40％CQDs的透射电子显微镜图像，其均匀分布且无团聚，显示为具有0.14 nm晶格间距的球形形状，与典型的CQDs特征相符。
图2. 1H核磁共振谱图（A）为0%、（B）20%、（C）40%、（D）60%的CQDs。0、20%、40%和60%的CQDs分别指以0、20%、40%和60%的乙醇作为溶剂合成的CQDs。
化学位移（δ）介于2.5至5之间的积分曲线归类为亲水分子，而其余的则被认为是疏水分子。根据公式计算，0％、20％、40％和60％CQDs的估计最佳的亲水和疏水平衡（HLB）值分别为7.05、7.43、8.83和7.56（表S1）。通常，当HLB值在3.5至6之间时，表面活性剂可以形成油包水（W/O）乳液，而在8至18之间时，可以形成水包油（O/W）乳液。因此，HLB值为8.83的40％CQDs被确定为形成PECEO的最佳固体颗粒。
图3. XPS分析不同类型的（A）0%、（B）20%、（C）40%和（D）60%CQDs。分别给出了（E）0%、（F）20%、（G）40%和（H）60%CQDs的C1s区域的高分辨率XPS光谱、（I）0%、（J）20%、（K）40%和（L）60%CQDs的N1s区域的高分辨率XPS光谱，以及（M）0%、（N）20%、（O）40%和（P）60%CQDs的O1s区域的高分辨率XPS光谱。（Q）给出了四种不同CQDs的傅里叶变换红外光谱。
这些结果表明，40％CQDs中HLB值的增加归因于C-O键的增加和COOH键的形成。
图4.CQDs的(A)表面张力和(B)界面张力。
60％CQD的表面张力高于40％CQD，与20％CQD相当。因此，界面张力和表面张力测量的结果证实了1H NMR分析确定的CQDs的HLB值，表明40％CQDs是皮克林乳化丁香精油（PECEO）形成的最佳乳化剂。
图5.使用CQD形成的PECEO的（A）平均液滴大小和（B）Zeta电位。
用40％CQD稳定PECEO的液滴大小比用0％、20％和60％CQD稳定时的小。随着表面活性剂的HLB值接近油相的HLB值，乳液的稳定性会增加。在PECEO与不同浓度CQDs的Zeta电位中。无论类型如何，所有的绝对值都大于40，这表明滴液之间有足够的静电排斥作用，可以防止团聚。
图6. (A) 使用40%乙醇合成的CQDs稳定O/W PECEO的共聚焦激光扫描显微镜图像。(B) 使用40%乙醇合成的CQDs稳定O/W PECEO的高分辨率透射电子显微镜图像。(C) 和(D) 与图B的上部相关，(E) 和(F) 与图B的下部相关，(G) 和(H) 与图B的左侧相关，(I) 和(J) 与图B的右侧相关。
在PECEO的荧光显微镜图像，有一个圆形的蓝色荧光环。小于10 nm的CQDs由于量子限域效应引起的能级变化而具有半导体特性。在PECEO的TEM图像中，PECEO的直径为4-5微米。在样品干燥过程中，多个滴液的聚集导致滴液尺寸增大，这一现象可以在图像中得到确认。在放大图像中，球形粒子具有小于10 nm的晶格结构。因此，这些发现证实CQDs位于水油界面，有助于形成PECEO。
图7.使用（A）0.2 mg/mL、（B）0.5 mg/mL、（C）1.0 mg/mL、（D）2.0 mg/mL、（E）3.0 mg/mL四种不同浓度的乙醇合成的CQDs制备的PECEO的滴液大小的变化。（F）40 % CQD浓度下界面张力的变化。
图8.图中展示了PECEO滴液的光学显微镜图像。PECEO分别用不同浓度的碳量子点（CQDs）进行稳定处理。图中（A）和（B）表示CQDs浓度为0.2 mg/mL，（C）和（D）表示浓度为0.5 mg/mL，（E）和（F）表示浓度为1 mg/mL，（G）和（H）表示浓度为2 mg/mL，（I）和（J）表示浓度为3 mg/mL。图中（A）、（C）、（E）、（G）和（I）是在PECEO形成后3小时拍摄的图像，而图中（B）、（D）、（F）、（H）和（J）是在7天后拍摄的图像。
图7和图8显示了PECEO中不同浓度40％CQDs的滴液尺寸的变化。随着CQDs浓度的变化，滴液的大小发生了显著变化。当使用40%的CQDs形成PECEO时，在浓度为0.2、0.5和1.0 mg/mL时，最初在3小时内显示出小滴液大小。然而，由于界面上吸附的固体颗粒不足，滴液大小随着时间的推移显著增加。这种CQDs覆盖会导致不均匀的乳液，促进滴液凝聚，并导致随后的快速增大。界面上足够的粒子随着时间的推移对凝聚的抵抗力增强，会形成均匀的乳液。与2.0 mg/mL相比，3.0 mg/mL的40% CQDs观察到更大的滴液大小增加，因为在较高浓度下，过剩的CQDs可能不会在界面上有效吸附，而是在液滴之间形成网络，这可以促进乳液不稳定性，不仅滴液大小显著增加，而且滴液之间还出现了聚集现象。因此，在CQDs浓度为2.0 mg/mL时，实现了最稳定的PECEO，作为乳化剂展现出最佳性能。
图 9. 图中展示了不同浓度的PECEO和Tween-80的乳丁香精油（TECEO）对（A）金黄色葡萄球菌和（B）大肠杆菌O157:H7的杀菌效果时间曲线图。
使用乳化剂可以显著提高CEO的表面积和水溶性，促进其在细菌表面的扩散。此外，PECEO表现出比TECEO更强的抗菌效果，随着治疗浓度和持续时间的增加，差异变得更加明显。
图 10. 用PECEO、TECEO和超声乳香精油（SCEO）处理30分钟后，观察到金黄色葡萄球菌（A）和大肠杆菌O157:H7（B）的细胞膜破坏。
当用SCEO处理金黄色葡萄球菌和大肠杆菌O157:H7时，未观察到细胞膜破坏的明显增加。然而，对于金黄色葡萄球菌，使用浓度为3 μL/mL或更高的PECEO与未处理的对照组相比，细胞膜破坏显著增加。相比之下，与对照组相比，TECEO需要4 μL/mL或更高的浓度才能实现膜破坏的显著增加。在相同浓度下，PECEO对细胞膜的破坏程度显著高于TECEO。对于大肠杆菌O157:H7，PECEO和TECEO在浓度为1 μL/mL或更高时均显著增加了细胞膜破坏。特别是在浓度为2µL/mL时，PECEO对膜的破坏效果优于TECEO。
图 11. 原子力显微镜图像展示了不同乳液类型的均方根粗糙度（Rq）。（A）由40%的CQDs（质量浓度为2mg/mL）稳定化的皮克林乳液。（B）由1%（w/w）的Tween-80稳定化的传统乳液。
PECEO的平均粗糙度为1.480 nm，而TECEO的平均粗糙度为0.098 nm，明显低于PECEO。PECEO相对于TECEO的表面粗糙度更高可能是由于纳米颗粒的聚集。小于10 nm的CQDs具有高比表面积（200-800 m2/g），具有高表面能。具有较高表面能的纳米材料倾向于聚集，从而形成更大的聚集体，这有助于增加表面粗糙度。因此，所观察到的PECEO和TECEO之间的膜破坏差异可能归因于乳化剂的性质。
图 12.荧光显微镜图像显示细菌与PECEO和TECEO的黏附情况：（A）金黄色葡萄球菌与PECEO，（B）金黄色葡萄球菌与TECEO，（C）大肠杆菌O157:H7与PECEO，以及（D）大肠杆菌O157:H7与TECEO。
在PECEO处理的样品中，观察到金黄色葡萄球菌和大肠杆菌O157:H7都粘附在乳状液滴上，绿色荧光细菌与红色荧光乳状液滴密切相关。相比之下，经TECEO处理的样品没有明显的细菌粘附，绿色和红色荧光基本分离。这些观察结果与假设一致，即PECEO与TECEO相比具有增强的抗菌效果，可能是由于更高的表面粗糙度促进了细菌相互作用的增加。
图 13. 使用PECEO和TECEO处理30分钟后，丁香精油在单层脂质体（ULs）中的渗透率。
处理30min后，PECEO和TECEO对ULs的渗透性均有所增加。PECEO的吸光度为1.34，显著高于TECEO的0.5047。PECEO具有优异的渗透性，这与之前用二氧化硅纳米颗粒和Tween-80制成的乳剂对ULs渗透性的测试结果一致，从而证实了PECEO比TECEO相对粗糙，更有效地附着在细菌上，并促进了丁香精油（CEO）向细胞膜的扩散。
本研究证明，来自丁香残渣的表面改性碳量子点（CQDs）是皮克林乳液有效的乳化剂，通过全面的表面化学分析得以证实。用于稳定皮克林乳液的CQDs显示出比使用吐温80稳定时更强的抗微生物活性。这种增强归因于CQDs独特的表面粗糙度和化学功能性，这增加了它们与细菌膜的相互作用，从而更有效地破坏细胞膜。此外，可以通过异原子掺杂对CQDs进行表面改性，使其带正电荷，从而同时利用静电相互作用和表面粗糙度进一步增强抗菌活性。因此，从农业副产品中制备CQDs代表了一种有前途的策略，可以创造具有双重功能（乳化剂和抗微生物剂）的高价值纳米材料。此外，本研究通过分析CQD浓度与滴液大小随时间的变化，评估了乳液的稳定性。此外，还进行了ζ电位测量，以确认存在静电排斥，为理解皮克林乳液的基本形成机制和稳定性提供了关键基础。本研究中开发的PECEO在食品和化妆品行业具有潜在应用，但需要进一步的研究和优化以满足每个领域的特定稳定性要求。总之，这项研究为基于CQDs的PE的形成和基本性质提供了有价值的见解，为未来在各工业领域的应用研究奠定了坚实的基础。
近期，该研究成果以“Synthesis and characterization of clove residue-derived carbon quantum dots: Application in Pickering emulsion with enhanced antibacterial properties”为题发表于学术期刊《Chemical Engineering Journal》。论文第一作者为Yong-Seok Seo，通讯作者为韩国东国大学的Jun-Won Kang。
撰稿人：姜 莹
审稿人：杨白洪
论文全文链接
https://doi.org/10.1016/j.cej.2024.158247
抗菌抗污材料前沿
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