革兰阴性菌(产生β -内酰胺酶( ESBLs ) )的传播是一个新兴的问题，ESBLs是质粒介导的能够水解β-内酰胺抗生素的酶，包括青霉素类、氟喹诺酮类等，提高了细菌的耐药性。因此，开发具有优良生物学特性和治疗潜力的新型材料替代抗生素以根除耐药病原体是十分重要的。
MXenes作为纳米材料显示了有效的抗菌潜力，其中Ti3C2Tx MXenes因其独特的层状结构和形貌，包括大表面积、极薄、高表体积比、机械稳定性和显著的载流子而受到广泛的关注。本文研究了多层（ML）Ti3C2Tx的抗超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）活性和体内毒性。结果表明ML-Ti3C2Tx具有良好的β-内酰胺酶灭活能力，在90µg/mL时对铜绿假单胞菌和肺炎克雷伯菌的抑制率分别为96%和94 %。ML-Ti3C2Tx的浓度依赖性活性氧（ROS）的产生显著降低了细菌细胞的生长，造成细菌外壁破裂及损伤。同时，Ti3C2Tx可诱导有效抑制β-内酰胺酶，为今后开发具有基因控制的耐药ESBLs提供了思路。
图1.ML-Ti3C2Tx的物理化学和形态学特征。
如图1a所示，所获得的粉末XRD模式是典型的Ti3C2Tx。多层Ti3C2Tx的FTIR谱如图1b所示，在~3378cm - 1处观察到的吸收峰表明存在来自吸附水分子的强氢键-OH基团的伸缩振动。Ti3C2(OH)2表面功能化后，位于~2920cm−1处的一个峰属于C−H键的对称伸缩振动。在氧气气氛中获得的Ti3C2Tx的TGA曲线如图1c所示。在~100和293℃时观察到两个阶段的体重减轻，而在360和480℃时观察到两个阶段体重增加。扫描电镜下的层状结构（图1d和e）显示，通过蚀刻法成功合成了多层Ti3C2Tx（图1）。
图2.多层Ti3C2Tx的不同放大率的HR-TEM图像（a-c）和(d) SAED模式。对获得的ML-Ti3C2Tx进行XPS分析，包括(e)测量扫描，以及(f) O1s、(g) C1s、(h) Ti2p和(i) F1s峰区的空间解析和数学拟合数据。
从HR-TEM显微图（图2a和b）可以看出，未制备的ML-Ti3C2Tx显示出规则的分层二维形态，各自的层数存在差异。此外，对不同放大图像的分析证实，ML-Ti3C2Tx较厚，由100-120层组成。ML-Ti3C2Tx的SAED模式表明，原子是有规律的，证实了它们的多晶行为（图2d）。用XPS方法研究了合成的多层Ti3C2Tx的表面化学性质，检测到的测量扫描显示存在O1s、C1s、Ti2p和F1s峰（图2e）（图2）。
图3. Ti3C2Tx处理的ESBL产生菌的抗ESBL活性和最低抑制浓度。
研究了Ti3C2Tx对高耐药的ESBLs产生铜绿假单胞菌和肺炎克雷伯菌的体外抗ESBLs活性。阿莫西林/克拉维酸的青霉素样抗生素通过MICe条对铜绿假单胞菌和肺炎克雷伯菌分别有0.46和0.38 mm的抑制区。Ti3C2Tx处理的孔对铜绿假单胞菌和肺炎克雷伯菌获得了14和16 mm的抑制区。Ti3C2Tx对铜绿假单胞菌（图3e-h）和肺炎克雷伯菌（图3i-l）的抗ESBLs活性具有时间和浓度依赖性(6-24h)（图3）。
图4.利用比色法对ML-Ti3C2Tx处理的ESBLs产生菌的β-内酰胺酶灭活效率进行监测。
Ti3C2Tx处理的铜绿假单胞菌和肺炎克雷伯菌的24孔板在加入淀粉碘溶液后1小时内使深蓝色脱色（图4a，b）。相比之下，空白孔没有经历任何颜色的变化，这表明Ti3C2Tx由于抗β-内酰胺酶抑制剂的产生而灭活的β-内酰胺酶在细菌细胞内受到影响，证明Ti3C2Tx是一种优良的抗ESBLs材料，该抑制作用呈浓度依赖性。此外，用拮抗条纹法验证了Ti3C2Tx抑制的β-内酰胺酶的致病性。结果表明，90µg/mL浓度比其他浓度更有效（图4）。
图5.Ti3C2Tx处理的产ESBLs细菌的ROS依赖性β-内酰胺酶抑制。
为了量化氧化应激对β-内酰胺酶毒力的反应，使用XTT评估了Ti3C2Tx的浓度依赖性的ROS产生活性。Ti3C2Tx的细胞内ROS产生潜能随浓度的增加而显著增加。在90µg/mL时，Ti3C2Tx暴露24 h后，通过氧化应激产生了相对较高数量的O2−（图5）。
图6.Ti3C2Tx灭活细菌细胞的CLSM图。
铜绿假单胞菌和肺炎克雷伯菌的CLSM图像显示Ti3C2Tx处理后，细胞内损伤的聚集和积累。未处理对照细胞的CLSM图像显示典型的未改变的杆状原始结构，紧密相邻的对数相菌落，仅为绿色荧光。Ti3C2Tx处理的细胞对应的图像显示了丰富的细胞分布、剧烈的菌群重排、细胞渗漏和其他形态变化，以及仅红色发射。此外，由于氧化应激的影响，可以观察到由于分散的浓缩细胞的死细胞表面持续的外力造成的结构坍塌。此外，与未处理的对照组相比，基于ROS的胞内膜改变图7e和k增加，受损细胞坏死区域增多，呈橙色，绿色和单个绿色和红色（图6）。
图7.Ti3C2Tx对盐水虾青蒿和成虫的毒性评价。
Ti3C2Tx对盐水虾具有较低的毒性。成虫在100µg/mL中6、12、18和24 h的游泳行为没有明显影响（图7）。
在本研究中，合成的ML-Ti3C2Tx的抗ESBL活性表明，其抑制作用取决于浓度和ROS的生成。在90µg/mL浓度下，ML-Ti3C2Tx的尖锐边缘随着功能金属离子转移到细菌表面表现异常良好，同时参与了β-内酰胺环的裂解和β-内酰胺酶的产生。此外，ML-Ti3C2Tx的-OH、-F和-O表面官能团参与了细胞膜损伤，导致电子从细胞内腔室转移到外部环境，从而产生ROS，破坏细菌细胞。这可能有助于针对新兴的细菌，并对耐药菌株表现良好的抑制能力。
近期，该研究成果以“Reactive oxygen species-dependent anti-extended spectrum β-lactamases activity of multi-layer Ti3C2Tx: A novel approach for treating successfully P. aeruginosa and K. pneumoniae”为题发表于学术期刊《Chemical Engineering Journal》，论文第一作者为Govindan Rajivgandhi，通讯作者为智利大学Franck Quero。
撰稿人：张晓静
审稿人：佘 雨
论文全文链接
https://doi.org/10.1016/j.cej.2024.157111
抗菌抗污材料前沿
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