伤口修复被称为用新再生的组织替换受损组织的过程，近年来细胞片技术得到了发展，以保留高密度细胞组织和细胞分泌的天然细胞外基质（ECM），并预防一系列疾病和术后并发症。但传统细胞片的中心层容易因营养缺乏或缺氧而坏死此外，在将细胞片转移到伤口部位的过程中，通常只有一小部分细胞留在目标区域，这可能导致与受损组织的附着不足。为了解决这些问题，我们提出了一种新的策略，包括制造由电刺激激活的薄细胞片，这可以促进细胞片的转移，增强细胞的生物活性，促进伤口的快速愈合。
为了解决这些问题，提出了一种利用机械和电刺激来制造细胞片的新方法。这种方法不仅有利于细胞片的转移，而且提高了细胞的生物活性。该膜在电刺激下具有机械控制的微观结构，其性能在体外和体内模型中都得到了验证。与扁平膜相比，微结构膜允许多种电刺激，从而加速细胞片的脱离，促进血管生成和再上皮化。这些发现表明创新的细胞片技术可以显著提高再生医学中伤口的快速愈合。
图1.可转移细胞片制造的示意图。
通过电刺激分离附着在导电多孔膜上的细胞片，其中膜具有机械控制的微孔结构。通过反向电刺激，可以加速细胞片的形成并转移到动物模型中。
图2.基于不同聚（3,4-乙烯二氧噻吩）聚苯乙烯磺酸盐（PEDOT:PSS）涂层时间的扁平膜和多孔膜的表征。
为了优化可能影响膜结构和力学性能的PEDOT:PSS涂层时间，使用FE-SEM分析了不同PEDOT:PSS涂层时间下平面和多孔膜的表面（图2A），涂层时间的增加导致PEDOT:PSS覆盖更厚，减少了表面孔隙率。在1000转/分钟的转速下，涂上9层涂层，膜表面的毛孔几乎不存在。图2B是四种膜的顶部孔径分布：平面膜（F5），在1000 rpm (P1), 3000rpm（P3）和5000rpm（P5）下不同自旋涂覆速率控制的多孔膜，尽管如此，在5000rpm下涂覆的膜表面仍然可以看到不同大小的孔，随着涂层次数的增加，膜的表面变得更加光滑。
图3. 基于不同时间PEDOT:PSS涂层的四种不同膜表面的表面力学性能和细胞增殖分析。
为了研究细胞在机械定制膜表面上的行为，制备了四种不同的表面：5000 rpm (F5）的平板膜，1000rpm (P1)， 3000rpm(P3）和5000rpm(P5）的多孔膜,每个膜分别涂上PEDOT:PSS 3、6、9次，采用原子力显微镜分析各膜的力学特性（图3A），F5膜的表面最光滑、最平坦。具有 3D 微孔结构的 PEDOT:PSS 膜具有最高的粗糙度和杨氏模量（图 3B、C）。随着PEDOT:PSS涂层次数的增加，每个表面的片材电阻和电导率都显著增加（图3D，E），P5膜的卓越导电性可能归因于其紧密集成的3D网络结构，这是由PEDOT:PSS涂层造成的。图3F展示了在不同的PEDOT:PSS涂层时间下，细胞附着来验证每种膜的生物活性特性。与多孔膜（P1、P3和P5）相比，F5膜上的细胞表现出较低的附着力。图3G是荧光强度用于评估每个膜表面的细胞活力和增殖，结果表明细胞活力随着PEDOT:PSS在平面和多孔膜上涂膜时间的延长而增加。
图4.电刺激和不电刺激3d时F5和P5膜上细胞的黏附和肌动蛋白丝的变化。
根据PEDOT:PSS涂层持续时间，图4A描述了在有和没有电刺激的情况下，细胞对胶原包被的F5和P5膜的粘附。图4B是MTT实验结果显示细胞活力和增殖在每层膜上，电刺激下细胞增殖的减少主要发生在F5膜上，而P5膜由于其微孔结构而表现出优越的功能。经电刺激的P5膜荧光强度最高，附着活细胞数量最多，超过了经电刺激和不经电刺激的F5膜。图4C是电刺激后3天各表面细胞肌动蛋白和DAPI染色的荧光图像，生长在F5膜上的角质形成细胞尺寸比生长在P5膜上的小，具有高粗糙度和刚度的微孔结构。图4D是电刺激下6次涂覆PEDOT:PSS的F5和P5膜上肌动蛋白网络的观察，F5膜的肌动蛋白网络较薄，细胞外周的肌动蛋白网络较少，而P5膜的肌动蛋白网络错综复杂，呈网状结构。肌动蛋白在P5膜中的表达增强，与F5膜相比，P5膜的细胞扩散更充分（图4E，F），肌动蛋白索部分固定在邻近细胞上，促进细胞片的形成。
图5.电阻监测在电刺激和体内实验程序下细胞片的形成和脱离。
经过3天的培养，细胞所贴膜的耐药性稳步增加（图5A）。随后对膜施加-200 mV的电压，观察到电阻下降，表明细胞片脱离（图5B），膜电阻增加的数据以线形图表示，而电阻下降的数据则用阶跃图表示，这表明膜电阻与细胞薄片脱离有关，而与细胞活力无关。如图5C所示，F5和P5膜在3天内形成细胞片，其中P5膜的细胞密度更高，经过 5 天的电刺激后，膜上的细胞片几乎完全脱落。与 P5 膜相比，F5 膜上剩余的细胞数量更多，这表明平膜上发生的脱落较少，细胞脱落可以归因于施加在膜上的负电荷。为了评估带有细胞片的P5膜的促愈合性能，制作了一个10毫米的大伤口并监测了7天（图5D）。
图6.体内伤口愈合实验。
图6A是创面组织照片，在电刺激下用胶原包被P5膜处理的伤口在第7天明显最小。图6B是 0、1、3、5、7天各组创面愈合率，结果表明，电刺激与胶原蛋白的协同作用比单独涂敷胶原蛋白更能使伤口快速恢复。此外，在电刺激下，胶原包被P5膜的伤口愈合速度比胶原包被F5膜更快，这凸显了微孔结构作为机械刺激物的优越功能。图6C是第7天不同条件下DAPI切片的H&E、CD31、TNF- rtp染色图像（箭头表示新形成的血管），在各条件下，F5膜处理伤口的肉芽组织形成少于P5膜处理伤口，在涉及P5膜的每种情况下，血管形成明显优于F5膜。采用免疫荧光染色法检测肿瘤坏死因子- rfs (TNF- rfs)，以验证创面愈合的效果与F5和P5膜条件相比（图6D-F）。
图7.免疫荧光染色K14， K10， Occludin和Claudin-1在每个创面皮肤上的细胞。
图7A是7天不同条件下再生创面组织的代表性图像，分别用K14（绿色）、K10（黄色）、Occludin（绿色）、Claudin-1（红色）进行免疫荧光染色，机械和电刺激导致本研究中观察到的K10和K14表达水平最高。在没有电刺激处理的情况下，F5膜上Occludin和Claudin-1的表达水平最低，而P5膜上细胞的荧光信号最高。图7B-E是定量统计分析F5、P5、PEDOT: pss包覆的F5、经电刺激和未经电刺激的P5膜各条件下K14、K10、 Occludin、Claudin-1的强度，电刺激下P5 PEDOT: pps包被膜的K14、K10、Occludin和Claudin-1水平最高。
本研究提出了一种新策略，通过3D翻转结构的导电膜促进细胞片增殖和增强细胞活性，从而加速伤口治疗。膜通过机械和电流刺激增强细胞水肿、肿胀及肌动蛋白形成，促进细胞间质形成。体内实验表明，电刺激组的创面治疗速度显着提高，电刺激组的创面治疗速度显着提高，电刺激下膜表现出相当的机械功能和生物活性，增强了细胞迁移、肿胀和泌尿。该研究为伤口快速治疗提供了一项新的技术，并推动了相关领域的临床应用。
近期，该研究成果以“Fast Autograft Generation Using Transferable 3D Keratinocyte Cell Sheet on PEDOT:PSS Composite PDMS Membrane for Enhancing Wound Healing”为题发表于学术期刊《Small》，论文第一作者为Yeongseok Jang，通讯作者为韩国全北国立大学Jonghyun Oh。
撰稿人：冉博文
审稿人：李克江
论文全文链接
https://doi.org/10.1002/smll.202406529
抗菌抗污材料前沿
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