慢性伤口是医疗保健系统面临的主要挑战之一，影响着全球数十亿人。与急性伤口愈合相比，慢性伤口愈合延长了炎症、增殖和重塑阶段，导致组织纤维化，从而会导致糖尿病足、静脉腿和压疮。血管形成不良、蛋白酶降解内源性细胞外基质 、生长因子活性减弱和细菌感染等各种因素都可能形成慢性伤口。迫切需要开发能够有效用作伤口愈合剂的先进材料。
考虑到以上事实，本研究合成了RGD肽模拟物的反向序列，即Fmoc-FFβA(K)RβA-NH2，其RGD肽模拟物的反向序列为-(K)-，本文将其简称为R-MNH2。MNH2和R-MNH2都携带相同的氨基酸组成，但氨基酸顺序相反，试图模仿部分。假设两亲性的R-MNH2肽由于在末端位置存在精氨酸片段而表现出增强的细胞粘附性和抗菌性能。因此，在自组装的纳米结构表面上可以很容易地获得丰富的胍基。研究了细胞粘附基序周围邻近氨基酸对肽的疏水性、电荷、自组装行为、水凝胶形成、细胞粘附行为和抗菌活性的影响。此外，还检测了所有先前合成的肽（MNH2,MOH和MR）以及反向对应物（R-MNH2）的伤口愈合潜力。
图1.RGD 和 RGD 肽模拟物的结构。
Fmoc-FFβA(K)RβA-NH2(R-MNH2)肽具有MNH2的反向RGD肽模拟序列[-R(K)-]，采用Fmoc化学的标准固相肽合成方法制备(图1)。
图2.MNH2和R-MNH2的光谱表征。
紫外可见光谱证实了R-MNH2的合成，其中210-220nm和260-280nm的峰分别由肽键和芳香部分(苯丙氨酸和Fmoc)贡献。在R-MNH2肽中，1H NMR谱显示苯丙氨酸和Fmoc的芳香质子峰，在DMSO-d6中分别在δ7.0-7.5ppm和δ7.6-8.0ppm左右，与肽MNH2相当。在δ1 ~ 2ppm范围内，亚甲基的峰清晰可见。δ2.5和3.3ppm的峰值是由溶剂引起的。在FTIR研究中，MNH2和R-MNH2都显示出β-sheet二级结构的特征峰，在1643和1548cm-1处显示出酰胺I和酰胺II峰，在1690cm-1处有一个小峰，证实了β-sheet二级结构(图2)。
图3. 水凝胶化研究。
两种放大倍数下的TEM图像所示，MNH2的平均宽度为7.07nm,R-MNH2的平均宽度为8.9nm。描述了对R-MNH2和MNH2肽进行的凝胶化研究，以确定使用反管法进行凝胶化所需的最小浓度。将肽样品简单地加入水中，在正常条件下孵育3小时。与MNH2相比，R-MNH2形成水凝胶所需的浓度更高，为15mM,而MNH2的凝胶浓度为10mM(图3)。
图4.体外抗菌活性。
为了比较MNH2和R-MNH2的抑菌活性，首先用蜡样芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌临床菌株进行抑菌区实验。这两种肽都显示出抗菌活性，这是由于带正电荷的氨基酸所赋予的正电荷(赖氨酸和精氨酸)。众所周知，富含赖氨酸和精氨酸的自组装肽表现出多阳离子表面，这是对一系列革兰氏阳性和革兰氏阴性菌株表现出抗菌活性的原因。它们的作用是破坏膜电位,接着是代谢物的泄漏,最后导致细菌细胞死亡(图4)。
图5.细胞粘附活性。
两种肽均具有生物活性，具有较强的细胞亲和性；然而，与相似浓度的R-MNH2相比，在所有被测试的细胞系中，MNH2肽处理过的孔上附着的细胞数量更多(图5)。
图6.体内伤口愈合试验。
在耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染的小鼠模型伤口中，评估了这两种肽以及其他先前合成的肽（即MOH和MR）的伤口愈合能力。所有治疗过的伤口病变都发现随着新表皮在伤口部位的生长，以更快的速度减少。在所有治疗组中，MNH2肽的伤口愈合速度最快，其次是MOH和R-MNH2，而MR的伤口愈合速度最低。（图6）。
在这项研究中，设计并开发了一个六肽R-MNH2[Fmoc-FFβA(K)RβA-NH2],具有RGD模拟基序R(K)的反向序列[(K)R]。比较了反向模拟R-MNH2肽与MNH2的凝胶形成倾向、体内伤口愈合和抗菌活性。反模拟肽R-MNH2显示出在生理pH下形成纳米水凝胶的潜力，但浓度高于MNH2肽。由于不同的构象，MNH2和R-MNH2肽形成的纳米结构的表面电荷也有所不同。R-MNH2肽在细胞中表现出细胞黏附活性，但黏附活性低于MNH2肽。HaCaT细胞的体外细胞相容性研究以及溶血实验表明，模拟肽R-MNH2和MNH2无毒。心脏、肝脏、肾脏、脾脏和肺等主要器官的组织学分析也未显示明显的炎症，表明所有RGD模拟肽的生物相容性和生物安全性。总体而言，MNH2肽纳米纤维在所有测试肽中表现出最高的细胞粘附、抗菌和伤口愈合性能。与R-MNH2相比，MNH2具有成本优势，因为它的凝胶浓度较低，因此可能成为感染皮肤伤口治疗的优秀候选者。
近期，该研究成果以“Self-assembled Arginine–Glycine–Aspartic Acid Mimic Peptide Hydrogels as Multifunctional Biomaterials for Wound Healing”为题发表于学术期刊《ACS Applied Materials & Interfaces 》，论文第一作者为Zeba Ahmadi，通讯作者为印度创新研究院Pradeep Kumar。
撰稿人：王 晟
审稿人：佘 雨
论文全文链接
https://doi.org/10.1021/acsami.4c14686
抗菌抗污材料前沿
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