Cell | 加州理工学院:利用高通量电化学技术研究低功耗细菌维持状态的机理

文摘   2024-12-07 17:22   重庆  

非生长细菌在生物被膜的核心,在许多慢性感染中发现了多细胞聚集体。临床上使用的大多数抗生素无法根除生物被膜,每年导致数百万人死亡。研究这种状态的一个基本问题是,在没有生长的情况下,需要多少能量来维持细胞的活力?以前的实验室尝试量化这个值,通过从连续培养中缓慢生长期间的测量值推断维持零生长所需的能量来推断维持代谢率。然而,这些估计值始终比在能量或营养来源有限的稳定自然环境中测量的代谢率高两到四个数量级,如何弥合两者之间的差距来研究支撑非生长维持代谢的细胞策略?因此,需要开发实验室系统,在其中研究与单细胞代谢活动测量相结合的零生长或接近零生长的代谢率。

在这项研究中,作者使用开发的高通量电化学系统研究了吩嗪胞外电子转移(EET)的生存代谢,该系统可以同时测量近100个浮游培养物产生的电流。同时提出一些问题:吩嗪EET介导的生存的代谢率是多少?它是如何测量的?在单细胞水平上,没有生长的细菌是在维持状态下存活,还是种群通过生长和死亡的平衡生存?哪种抗生素可以杀死这种生理状态下的细胞?哪些酶参与了它的分解代谢?总的来说,实验结果揭示了在与生物膜耐抗生素核心相关的缺氧条件下,为铜绿假单胞菌细胞提供能量的最低代谢需求和途径。


图1.PCN氧化还原循环通过促进发酵促进厌氧能量保存和生存。

铜绿假单胞菌是一种机会性病原体和模式生物膜形成生物,产生吩嗪,这是一类广泛存在的彩色、杂环、氧化还原活性代谢物。吩嗪类药物促进生物膜发育并减弱生物膜区域缺氧的代谢(休眠),使细胞在生理上对常规药物具有耐受性。使用低通量电化学反应器,曾证明了吩嗪类化合物作为细胞外电子穿梭体,促进厌氧生存代谢,支持存活,但不支持大量种群的生长。通过这种方式,ATP是通过一种非规范的能量守恒形式产生的,其中细胞外电子穿梭的减少促进了SLP和有机酸的排泄。鉴于这种发酵能量守恒途径需要使用外源性氧化剂来平衡氧化还原,我们将其称为促进发酵。因为它支持在没有生长的情况下存活,推断这种促进发酵的速度可能揭示了在这些条件下维持细胞所需的代谢通量。为了评估在这些不同条件下具有代谢活性的细胞的百分比,用荧光活性染料碘化丙啶对第5天的培养样品进行染色,结果发现,相对于PI染色,PCN循环所维持的种群似乎是均一的(图1)。


图2.PCN促进的发酵代谢率极低。

与之前研究结果相比,+PCN/pot培养物在其存活期间产生的电流特征是初始的尖峰,随后电流下降,在第1天至第7天之间保持稳定状态。由于在PCN/pot条件下,锋电位出现在死亡发生之前,这可能反映了细胞对新条件的调整,因此我们将较低的、稳定的电流解释为存活代谢。在25℃条件下,通过对第1 ~ 5天的电流和相关CFU进行统计,估计了在25℃下存活细胞的整体细胞特异性代谢率为1.6×103 电子/秒/细菌(图2)。


图3. 通过PCN促进的发酵,在厌氧生存过程中单细菌不生长。

在培养基中验证了HADA对铜绿假单胞菌的作用后,将其应用于电化学反应器中观察。结果发现,在+PCN/pot条件下,HADA染色的细菌在整个细胞壁中保留了7天的HADA。在接种物从缺氧转移到缺氧的过程中,一些未完成分裂的细菌具有HADA标记的间隔,即使在厌氧培养7天后仍保持完整。HADA的存在不影响+PCN/pot和-PCN/pot培养的存活或活力丧失。最后,对每天和每个条件下至少400个细胞的HADA标记和未标记的极进行计数,以估计整个群体的分裂数量,这些值接近于零。在厌氧PCN EET过程中,细菌在没有生长的情况下静态存活(图3)。


图4.高通量电化学反应器系统允许多重依赖吩嗪的厌氧生存测定。

开发了一种96孔的电化学系统,该系统在每孔底部使用了印刷碳电极,可以进行独立的、多路的恒电位测量。定量比较了存活表型,在高通量平台的相同条件下(即培养基和PCN浓度),细菌在PCN和氧化电位存在下的存活率提高了几个数量级,但由于检测量增加,还能够测试许多其他浓度的PCN,结果表明,细胞在缺乏PCN的情况下以更快的速度死亡,并且无论PCN浓度如何,所有培养物在第5天后都失去了活力。有趣的是,作者还利用高通量平台来测量厌氧PCN循环支持的非生长状态下细胞的抗生素耐受性。在96孔装置中孵育一天后,我们添加了五种不同的药物(头孢他啶、环丙沙星、妥布霉素、ATP(合成)酶抑制剂、粘菌素),代表不同的抗生素。结果发现,头孢他啶和环丙沙星对细菌活力有轻度损害,妥布霉素对细胞活力有中度损害,ATP(合成)酶抑制剂和粘菌素对细胞活力有较大影响。这些结果表明在没有生长的情况下维持膜完整性的重要性和生物能量活性,以保持生存能力(图4)。


图5.高通量PCN氧化还原循环实验揭示了对NADH脱氢酶的依赖和接近最低维持需求的生存。

为确定PCN循环量是否限制了生存,通过EET产生的电流的量成正比的电子穿梭提供的浓度假设PCN浓度,从而限制总培养物的代谢率,测量了三个数量级的PCN浓度。结果发现,电流产生的早期峰值取决于吩嗪浓度,然后衰减到更低、更稳定的电流。此外,在750 mM PCN处,尽管后来电流稳定,但它产生了高度可变的初始电流。通过对第1天至第5天(即初始电流峰值之后)产生的电流进行积分,计算了不同PCN浓度下PCN的平均氧化速率,说明在厌氧条件下约1天后,超过一定浓度的PCN的细胞还原速率减弱(图5)。



细菌在营养或能量有限的情况下可以存活很长一段时间,但由于技术限制,细胞如何在没有生长的情况下保持活力的问题一直具有挑战性。事实上,无法成功治疗慢性感染,其中细菌代谢活跃,但反之非常缓慢或根本没有,这在很大程度上是因为我们对生长停滞期间维持生命的分子策略的无知。这个工作表明,通过研究P. aeruginosa如何在缺氧条件下循环phenazine PCN(一种在极低功率输出下运行的非生长状态,适合高通量的定量研究),有可能获得对P. aeruginosa维持生理学的机制洞察。此外,研究结果强调了动力学在解释微生物代谢的可塑性方面的重要性。慢动力学似乎可能主导低能量维持代谢的生物能量现实代谢率是否、如何以及何时由细胞在分子水平上控制或受施加的环境条件限制是未来研究中需要解决的重要问题,也是理解地球上微生物生命主导节奏的关键。



近期,该研究成果以“Mechanistic study of a low-power bacterial maintenance state using high-throughput electrochemistry”为题发表于学术期刊《Cell》,论文第一作者为John A. Ciemniecki,通讯作者为加州理工学院Dianne K. Newman


撰稿人:李克江

审稿人:冉博文

论文全文链接

https://doi.org/10.1016/j.cell.2024.09.042

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