生物相容性化学的不断发展使得生物材料能够模仿动态多功能细胞外基质(ECM)执行刺激触发的功能，包括动态基质硬化和软化，药物释放，干细胞分化，生物粘附，和生物降解。高度需要整合多种功能、模拟细胞外基质(ECM)微环境以支持细胞生长并牢固粘附于受损组织的生物材料来推进组织工程。在水凝胶中无缝结合多种功能的能力，如强大的组织粘附、动态生物力学调节、刺激响应性，同时保持其支持长期细胞培养和改善组织生物制造的能力，是推进组织工程应用所迫切需要的。
在本文中，通过利用二硫杂环戊烷的独特能力产生所需的原位硫醇，开发了一类新的二硫杂环戊烷修饰的、基于蛋白质的生物材料，其结合了独特的、看似相反的组织工程功能。二硫杂环戊烷改性的明胶能够实现无光引发剂的光交联，以形成多功能明胶-二硫杂环戊烷(GelDT)水凝胶，其在细胞培养基中显示出优异的长期稳定性(> 28天)，以支持表面接种的和包封的细胞的生长。此外，GelDT能够共价固定生物活性分子，谷胱甘肽响应性药物释放，由于其剪切稀化能力而支持有效的3D生物打印，并由于与内源性组织硫醇共价二硫键偶联而在各种情况下表现出强大的组织粘附。总之，这项研究提出了一种新的多响应和多功能的蛋白质基生物材料，有望推进组织工程和再生。
图1.硫辛酸缀合的明胶能够进行无光引发剂的光交联和光引发剂辅助的可见光交联以形成水凝胶。
硫辛酸(LA)包含一个二硫杂环戊烷环，该环响应于各种刺激而断裂并产生反应性硫醇。将LA与基于蛋白质的生物材料(如明胶)结合，可以使材料以动态硫醇-二硫键交换的形式利用硫醇的力量，从而形成新型、动态、多功能的基于蛋白质的水凝胶。并且可以控制反应参数(EDC /镧/巯基乙醇的量)来合成具有可调程度的二硫杂环戊烷修饰的GelDT。作者使用时间扫描流变仪评估了GelDT溶液在暴露于UV时发生胶凝的能力，当暴露于365 nm波长时，GelDT溶液经历了二硫杂环戊烷开环聚合，并在10-30秒内(取决于浓度)形成了透明的水凝胶，而不需要光引发剂。频率扫描流变性证实了在所有选定浓度下聚合时形成了坚固的网络，并在整个测试频率范围内都是稳定的（图1）。
图2.GelDT水凝胶在细胞培养环境中具有生物力学稳定性和高度稳定性。
为了突出GelDT在生物医学应用中的可调性，我们研究了GelDT的机械性能。2.5% GelDT制备水凝胶非常软，难以进行压缩测试。当浓度从5% w/v增加到10% w/v时，观察到压缩模量增加了约1.5倍，而当浓度从10%增加到15%时，压缩模量进一步增加了约1.3倍。基质的应力松弛率在2D和3D中显著调节细胞反应，当浓度增加，GelDT水凝胶的应力松弛率显著降低。作者将10% GelDT溶液暴露于紫外光下一系列照射时间，压缩模量随时间增长，这可能是由于更多二硫杂环戊烷环的打开，导致交联增加，并且在2.5分钟确保了完全凝胶化。交联1分钟的凝胶显示出更快的应力松弛，这是由于不完全聚合使得链在应力下松弛。在多种溶剂条件下，GelDT具有相同的模量(≈180 kPa)，表明达到了相似的交联密度。GelDT凝胶在生理条件下十分稳定，并且含血清培养基中的谷胱甘肽水平不影响GelDT水凝胶，这对体外体内应用都是重要的（图2）。
图3. GelDT凝胶化前和凝胶化后的改变。
明胶在化学修饰后保持其溶胶-凝胶转变的能力在调节明胶基水凝胶的机械性能中起着重要作用。为了检验物理化学交联的效果，将10% GelDT溶液在4℃下温育1小时以引入物理凝胶化，然后用紫外光照射10分钟以引发二硫杂环戊烷交联。得到的凝胶被命名为“GelDT+”。机械测试显示与GelDT相比，GelDT+的压缩模量增加了约3倍，可能是由于在物理凝胶化过程中形成了部分三螺旋结构，使GelDT链更加紧密；GelDT链的更高接近度导致侧链二硫戊环基团在曝光时反应更完全。与GelDT相比，GelDT+表现出明显更慢的应力松弛速率。外部硫醇的引入加速了硫醇-二硫化物交换，也提供了一种调节二硫化物交联水凝胶的机械特性的方法。无论PEG-4SH处理时间如何，水凝胶样品的压缩模量都没有显著变化。并且在足够长的时间内可以获得过量的硫醇，导致硫醇-二硫化物交换增加，从而允许10% GelDT更快松弛（图3）。
图4.GelDT支持2D细胞培养。
为了研究GelDT的生物相容性，我们在5%和15%的GelDT上培养3T3成纤维细胞，然后与GelMA和聚苯乙烯作为对照进行比较。在GelDT和GelMA上，与5%水凝胶相比，15%水凝胶的细胞粘附密度更高，与聚苯乙烯相当，可能是由于更高的硬度。F-肌动蛋白染色显示与15% GelMA相比，在15% GelDT上的细胞铺展相对更多。角膜内皮细胞(CE)很难在体外生长，在10% GelDT上培养CE细胞，7天后的图像显示在10% GelDT表面上的CE细胞的汇合单层，与聚苯乙烯相似。共聚焦图像显示单层表达特征性ZO-1紧密连接蛋白，表明GelDT水凝胶为CE细胞单层形成提供了最佳微环境，证实GelDT的生物相容性良好（图4）。
图5.GelDT 擅长作为3D细胞培养的支架。
在5% GelDT中培养HuCCT-1细胞，以GelMA作为对照，与GelMA相比，GelDT为HuCCT-1肿瘤样生长提供了更好的微环境。与5% GelMA相比，GelDT中的肿瘤样物显示出没有中央腔的致密形态和/或具有中央腔的囊肿样肿瘤样物。在第7天，GelDT中的肿瘤样物质明显大于GelMA水凝胶中的肿瘤样物质。此外，细胞显示出更高的代谢活性和更高的增殖。与GelMA中的静态共价交联相比，GelDT中的动态二硫键可能允许更大的基质重塑，从而使GelDT成为更好的3D培养支架。细胞角蛋白7和19已被用作胆管癌的预后标志物，并与患者的肿瘤侵袭性和低生存率相关，与GelMA中的细胞相比，5% GelDT中的肿瘤样细胞边界处CK7和CK19的表达较强。与GelMA中的肿瘤样物质相比，GelDT微环境中的肿瘤样物质更好地再现了肿瘤样特征，这可能是因为GelDT能够更好地模拟体内细胞外微环境的动态（图5）。
图6.GelDT Bioink实现无光引发剂生物打印。
为了探索GelDT作为不含光引发剂的生物链接的应用，进行了一项流变研究，评估了GelDT的剪切稀化、屈服应力和自修复性能。与10%和7.5% GelDT相比，12.5% GelDT在较低的剪切速率下表现出最高的储能模量。随着剪切速率的增加，所有三种浓度的粘度均降低，证实了GelDT的剪切变稀性质。12.5% GelDT的粘度达到峰值，然后在2s-1剪切速率后由于凝胶破裂而迅速下降，这种现象归因于高浓度GelDT的快速物理胶凝。在基于挤压的生物打印中，打印参数和形状保持力取决于生物墨水的粘度恢复。悬丝测试显示最大悬挂细丝长度随着浓度的增加而增加，而12.5%的GelDT倾向于更快地物理胶凝，因此10%被考虑用于细胞的生物打印。通过评估MDA-MB-231细胞的存活力和增殖来评估生物打印支架的生物相容性，其中存活力从第1天到第7天保持> 95%，并且细胞的增殖状况良好（图6）。
图7.GelDT允许固定含硫醇的生物活性分子。
将生物活性分子，如生长因子和信号蛋白，结合到生物材料基质上是增强生物相容性和在基质中指导细胞功能的关键策略。由于GelDT在光交联过程中产生游离硫醇，作者猜想将表皮生长因子与这些游离硫醇相互作用，导致EGF在GelDT基质中的固定化。作者分析了GelDT在一周内装载和保留EGF的能力，当在PBS中孵育7天时，从GelMA中释放的EGF占加载量的百分比显著更高，表明蛋白质随着时间推移更好地保留在GelDT基质中，由于GelDT是稳定的，在PBS缓冲液中不降解，证明EGF的释放不是由GelDT的降解介导的。定量评估显示，与GelDT–EGF相比，在GelDT + EGF上培养的细胞增殖约高3倍，表明与GelDT缀合的EGF保持了生物活性（图7）。
图8.光学透明的GelDT显示出强大的离体和体内组织粘附。
硫醇通常以半胱氨酸残基的形式存在于ECM中，并且在体内广泛观察到硫醇-二硫键交换。为了评估GelDT的组织粘连，我们使用离体兔角膜作为模型，以纤维蛋白胶和GelMA作为对照。与GelMA相比，GelDT对暴露基质的粘附强度显著更高，并且略高于纤维蛋白胶。作者推测上皮损伤暴露了含有较高浓度ECM蛋白的基质，并在其中产生巯基，这导致了GelDT和组织之间更多的二硫桥，增加了粘附强度。使用Algerbrush毛刺在小鼠角膜上造成伤口尺寸为2毫米、20至30微米深的基质消融损伤。将10% GelDT预聚物溶液立即施用于伤口部位，并通过蓝光进行光交联，以评价GelDT用于封闭和修复角膜缺损的生物粘附性和生物相容性。GelDT和纤维蛋白都保持透明，并且牢固地粘附到患有睑板腺囊肿的眼睛的角膜表面。在没有睑缘炎的眼睛中，发现GelDT保持稳定地粘附在角膜缺损上，而纤维蛋白胶凝胶在6和24小时都错位或丢失，表明GelDT的生物粘附强度更强。角膜的冷冻切片显示GelDT是安全的，支持组织整合，并且不会引起可能延迟组织愈合和再生的副作用。虽然使用GelDT类似于纤维蛋白的效果，但是GelDT具更高的可调性（图8）。
总之，这项研究利用了二硫杂环戊烷独特的原位生成硫醇的能力，为开发一类新的二硫杂环戊烷修饰的蛋白质基生物材料铺平了道路。GelDT表现出出色的长期稳定性，支持2D和3D培养，具有生物力学性能和生物降解的预凝胶调节，还证明了基质应力松弛率对外源硫醇反应的凝胶化后可调性。此外，GelDT展示了谷胱甘肽响应性药物释放，促进了有效的3D生物打印，有利于含硫醇生物活性分子的固定，促进了组织再生，并且在不同的情况下显示了强大的组织粘附。总的来说，GelDT代表了一种新型、多响应和多功能的基于蛋白质的生物材料，其预期应用扩展到各个领域，有望推进组织工程和再生。
近期，该研究成果以“Multi-Functional Gelatin-Dithiolane Hydrogels for Tissue Engineering”为题发表于学术期刊《Advanced Functional Materials 》，论文第一作者为Saad Asim，通讯作者为美国德克萨斯大学生物医学工程系Muhammad Rizwan教授。
撰稿人：李珂欣
审稿人：姜 莹
论文全文链接
https://doi.org/10.1002/adfm.202407522
抗菌抗污材料前沿
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