最近，联合治疗方法已经在临床实践中应用，使用高分子或超分子组合物作为药物附着和固定的基质。由于空间预组织的结构和空缺的宏环腔，宏环化合物是新型抗菌剂的普适候选物。目前，柱[n]芳烯能够通过多种药效团基团进行功能化并能够自组装成纳米薄膜、纳米层、离子通道和凝胶，正作为宏环抗菌剂被积极研究。宏环腔的存在使得柱[n]芳烯能够形成稳定的主客体复合物，从而使其在联合治疗细菌性疾病时，在作为抗菌药物的载体方面具有应用潜力。
柱[5]芳烯化学的发展提出了一个新的概念，旨在将超分子组装体应用于创建具有可变表面形态和生物活性的抗菌薄膜。抗菌薄膜来源于含有九个药效团胍基片段和一个硫代烷基取代基的取代柱[5]芳烯。通过改变宏环结构中唯一的硫代烷基片段，可以调控所得到的抗菌涂层的生物活性。使用柱[5]芳烯水溶液对表面进行预处理时，革兰阳性金黄色葡萄球菌的生物膜厚度减少56±10%，革兰阴性肺炎克雷伯菌的生物膜厚度则减少了52±7%。与此同时，合成的宏环在50μg/mL的浓度下进行了细胞毒性测试，其毒性显著低于基于双胍类的抗菌制剂。
图1.宏环12-14的结构及示意图，展示了宏环12-14的相互作用过程和抗菌薄膜的形成。
本研究的主要思路是将九个胍基药效团片段与一个疏水性烷基取代基结合在柱[5]芳烯结构中，并控制自组装过程，最终形成具有不同表面形态的超分子组装体。这些薄膜的抗菌活性将根据致病微生物的类型而有所不同。
图2.(A)宏环4在DMSO-d6中的1H NMR谱图；(B)宏环13在DMSO-d6中的1H NMR谱图。
宏环4和13的1H NMR谱图的比较分析清楚地与所合成化合物的拟议结构相符。
图3. (A–C)宏环12-14在水中浓度为1×10⁻⁵ M时的动态光散射（DLS）结果；宏环(D)12、(E)13和(F)14在298 K下，D2O中浓度范围1×10⁻⁴到 1×10⁻² M时的扩散系数变化。
宏环12–14的自扩散系数随浓度的变化而不同。对于宏环12和13，在浓度范围1×10⁻⁴到1×10⁻² M的重水溶液中，自扩散系数呈单调下降（12从4.65×10⁻10降至2.59× 10⁻¹⁰ m²/s，13从4.21×10⁻¹⁰降至2.30×10⁻¹⁰ m²/s）。这表明，由于形成了自组装体，宏环12和13的移动性下降。当宏环浓度从1×10⁻³ M增加到 1×10⁻² M 时，宏环12和13的自扩散系数趋于平稳。进一步增加12和13的浓度不再导致自扩散系数的变化。对于宏环14，也观察到了类似的现象。自扩散系数在3.71×10⁻¹⁰到4.97×10⁻¹⁰ m²/s范围内变化。然而，当宏环14的浓度达到 5×10⁻⁴ M 时，自扩散系数的变化停止。
图4.宏环12的疏水相互作用机制展示了两个分子的 (A) 正视图和 (B) 侧视图。(C) 三个样品的接触密度在400 ns后达到平台期。(D) 12个分子形成的两个类胶束聚集体的集合体。红色小球代表疏水核心和尾部，蓝色线条表示胍基残基。水分子和对离子未显示。
为了进一步评估宏环12-14自组装体在溶液中的形成，采用了全原子分子动力学模拟方法。对于宏环12，自组织是由于分子疏水部分之间的相互作用而发生的。对于宏环13，其自组织机制类似。因此得出结论，当接触密度接近2时，形成了聚合物超分子结构。这意味着形成了一个空间上连通的网络，结构演化为类蠕虫胶束，并且具有分支的可能性。样品14的烷基尾基相比于宏环12和13的烷基尾基具有更高的部分电荷。在模拟中，柱[5]芳烯之间的自组装主要是由不带电的尾基之间的相互作用决定的，这就导致了样品14的接触数目减少。
图5.宏环12-14及其组合物在水中浓度为1×10⁻⁵ M时的透射电子显微镜（TEM）（A-D）、扫描电子显微镜（SEM）（E-G）图像。
宏环12所形成的薄膜表面由树枝状自组装体组成，平均尺寸为 400 nm。宏环13和14，TEM图像显示出有序的尖椭圆形自组装体（针状，厚度为 18 nm，长度为 350 nm），这些自组装体形成了致密的聚合物网络，13的纤维厚度为300 nm。宏环14特征性地形成了经典的网络聚合物，纤维厚度为20 nm。对于12/13/14（1:1:1，1×10⁻⁵ M）系统，观察到不均匀结构的形成。SEM 图像显示，所有研究的样品12-14都是薄膜。宏环12的自组装体形成了一种致密的、均匀的纳米孔薄膜，孔径为100 nm。宏环13和14的薄膜具有类似的形态，但在包装密度上有所不同。13和14的薄膜具有网络结构，且其中的聚合物纤维相互交织。
图6.(A)含有不同浓度宏环12的培养板照片，展示了金黄色葡萄球菌（S. aureus）生物膜的形成情况。(B)使用宏环12溶液对培养板粘附表面进行预处理对金黄色葡萄球菌生物膜形成能力的影响。(C)使用宏环13 和14 溶液对肺炎克雷伯菌（K. pneumoniae）生物膜形成能力的影响。
宏环12使S. aureus生物膜的厚度减少了56±10%。宏环13能够抑制K. pneumoniae生物膜的形成。宏环14作为薄膜的抗菌活性仅在使用高浓度溶液（1×10⁻³和1×10⁻⁴ M）预处理孔板的情况下表现出来，分别减少了K. pneumoniae生物膜的26±7%和39±14%。
图7.S. aureus生物膜的共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）图像：(A)未处理的对照组，(B)预处理过的玻璃载玻片上，使用宏环12，(C)预处理过的玻璃载玻片上，使用宏环13；K. pneumoniae生物膜的 CLSM 图像：(D)未处理的对照组，(E)预处理过的玻璃载玻片上，使用宏环12，(F)预处理过的玻璃载玻片上，使用宏环13。细菌生物膜使用 DiOC6（绿色荧光：活细胞）和PI（红色荧光：死亡细胞）染色。
在对照孔中，建立了厚度为20-22 μm 的两种微生物的刚性生物膜。在预处理过宏环12的孔中，观察到了S. aureus生物膜生长的显著抑制。在预处理过宏环12和13的孔中，也发现了K. pneumoniae生物膜的抑制。
图8. (A) A 549（人体腺癌细胞）细胞、(B) LEK细胞、(C) HSF（人皮肤成纤维细胞）细胞在与宏环4和12-14共孵育24小时后的存活率。(D) 通过MTT测定法得到的宏环4和12-14对 A 549、LEK 和 HSF 细胞的半数致死浓度（IC50）值。
MTT试验中的大环化合物对多种细胞系显示出相似的毒性特征。宏环4、12和13在浓度≥25 μg/mL时会降低A 549、LEK和HSF细胞的活力。宏环14在浓度≤5 mg/mL时对A 549、HSF和LEK细胞没有显著的细胞毒性作用。在半数抑制浓度（IC50）中，在浓度大于40 μg/mL时，研究的宏环4、12和13对A 549和LEK细胞具有明显的细胞毒性。HSF细胞对宏环4和13的敏感性高于A 549和LEK细胞（IC50值分别为26.35和39.97 μg/mL），而宏环14未引起细胞活力显著降低。环状化合物14对A 549、LEK和HSF细胞均无毒性（IC50值分别为43.74、40.64和26.67 mg/mL）。
图 9. 宏环4和12-14对LEK、A549和HSF细胞在孵育24小时后的诱导凋亡效果。VC：存活细胞；EA：早期凋亡细胞；LA：晚期凋亡细胞；DC：死亡细胞（可能为坏死细胞）。
所有处理变体中DiOC6+/PI+ (DC)细胞的微量表明，所测试的化合物没有破坏膜的作用。
在本研究中，作者利用超分子组装体来创建抗菌薄膜，可以调控所得到材料的表面形态和生物活性。抗菌薄膜是基于含有九个药效团胍基片段和一个硫代烷基取代基的取代柱[5]芳烯12–14制得的。通过动态光散射、二维核磁共振谱和全原子计算机模拟，证明了合成的柱[5]芳烯12-14能够在水溶液中形成超分子聚集体。水分被去除后，它们转变为薄膜形式的超分子结构。所得到薄膜的形态通过透射电子显微镜进行了表征。对于宏环13和14的体系，通过原子力显微镜测定了其粘附特性。宏环13和14所形成的薄膜的最大附着力分别为7.2 nN（13）和4.9 nN（14），比不含烷基取代基的十取代宏环4的附着力高出1.5个数量级。这一事实表明，宏环13和14的超分子体系能够附着到固体表面，从而保证抗菌薄膜在界面处的稳定形成。通过改变宏环结构中唯一的硫代烷基片段，可以调控所得到的抗菌涂层的生物活性。使用含有亲水疏水两亲性的柱[5]芳烯水溶液对表面进行预处理时，结果显示，柱[5]芳烯12（含硫代辛基片段）能够使革兰阳性金黄色葡萄球菌的生物膜厚度减少56±10%；而柱[5]芳烯13（含硫代十八烷基片段）则使革兰阴性肺炎克雷伯菌的生物膜厚度减少52±7%。与此同时，合成的宏环在50 μg/mL浓度下的细胞毒性显著低于基于双胍类的抗菌制剂。本文材料为新一代抗菌涂层的开发提供了广泛的应用前景。
近期，该研究成果以“Antibacterial Activity of Various Morphologies of Films Based on Guanidine Derivatives of Pillar[5]arene: Influence of the Nature of One Substitute on Self-assembly”为题发表于学术期刊《ACS Applied Materials & Interfaces》。论文第一作者为Yulia I. Aleksandrova，通讯作者为喀山联邦大学的Ivan I. Stoikov。
撰稿人：姜 莹
审稿人：李珂欣
论文全文链接
https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsami.3c18610
抗菌抗污材料前沿
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