伤口愈合是一个明显的临床问题，它会受到血管生成不足、炎症和慢性缺氧的阻碍。脂肪来源的干细胞(ADSC)来源的外泌体已经成为组织再生中有前途的治疗剂，这主要归因于它们作为细胞间通讯器的功能，并含有丰富的生物活性分子，包括蛋白质、核酸和脂质。这些分子通过发挥抗炎作用、抑制细胞凋亡、促进血管生成以及促进细胞迁移和增殖来促进伤口愈合，但是由于激活的缺氧诱导的内吞再循环，缺氧组织中的细胞内货物递送受到损害。
为了应对这一挑战，作者开发了一种策略，利用脂肪干细胞(ADSC)衍生的外泌体包被的BSA基氧纳米泡(EBO)包埋在自愈合水凝胶基质中作为多功能伤口敷料。氧纳米泡(ONB)是通过将纳米级氧泡封装在由葡聚糖结合的BSA组成的糖基化蛋白结合物中而形成的，然后通过超声空化产生的大量纳米级氧气泡形成ONB。将ADSC外来体被进一步涂覆到ONB的表面上，产生最终的携氧纳米系统，其显示出氧释放特性并促进外泌体的细胞内递送。氧纳米粒子包覆在聚乙烯醇/明胶杂化水凝胶中不仅减轻了伤口缺氧，而且提供了一种在缺氧条件下递送外来体包被的纳米颗粒的有效方法。这种多功能水凝胶在雄性大鼠全层伤口模型中展现了有意的增强愈合、促进血管生成、促进外泌体递送、减轻缺氧和抑制炎症的潜力。
图1.EBO的合成与表征。
为了生产EBO，最初的步骤包括制备ONB，随后用外泌体膜包被。作者从人脂肪组织中分离出ADSCs，并提取和鉴定这些ADSCs来源的外泌体。外泌体具有典型圆形或杯形形态，其直径约为100纳米。ONB的合成始于通过混合物将BSA与硫酸葡聚糖结合，随后进行超声处理。同时，在整个超声处理过程中向系统中引入氧气。超声处理诱导的机械力导致外来体结构的短暂破坏，允许外来体在ONB周围重组，形成TEM所显示的核-壳结构。Dio标记的EBO可以内化到HDF-a细胞中。UV图谱以及电泳证实了超声处理可以诱导蛋白质和多糖的成功结合（图1）。
图2.EBO凝胶的特性。
PVA、明胶和EBO的水性混合物是低粘度液体，在添加2%的硼砂时，短暂的交联快速形成硼酸酯键，几秒钟内产生粘弹性水凝胶。EBO凝胶的倾斜小瓶具有足够高的粘度，可以在5分钟的观察时间内抑制流动，在约100帕的重力应力下，隐含粘度约为 η ~ 104Pa·s 。EBO凝胶可以用手从注射器中挤出，这证实其具有剪切变稀的效果。这种可注射的设计进一步促进了与缺损形状的一致性，使得精确和定制的应用成为可能。EBO凝胶显示出与空白凝胶相比更粗糙的表面，纳米级颗粒粘附在凝胶骨架上，表明存在EBO。多个实验共同证实EBO凝胶可用于自愈合，并且即使在受到应变后也能保持其流变性质，并且还具有良好的粘性，为后续做敷料提供良好条件（图2）。
图3. EBO凝胶的供氧和抗氧化性能。
在10小时的检测下，EBO凝胶和ONB凝胶显示出在低氧条件下的供氧能力，这将支持后续体内实验中每2天更换敷料以维持伤口床的最佳氧水平的需求。通过使用RDPP作为细胞缺氧指示剂来研究人真皮成纤维细胞(HDF-a)细胞中的缺氧，用EBO凝胶和ONB凝胶孵育的细胞显示出低RDPP荧光强度，表明有效的缺氧缓解，这同样验证EBO凝胶的优异细胞供氧能力。ROS清除性能可归因于两个主要因素:(1)凝胶中硼酸酯键的存在使其能够响应H2O2并促进其分解；(2)来源于ADSCs的外泌体具有抗氧化特性。对HDF-a细胞的荧光检测进一步证明了EBO凝胶的ROS消除能力（图3）。
图4.外泌体递送增强研究。
为了探索外泌体递送效率，将HDF-a细胞与CFSE标记的外泌体共培养，通过免疫荧光评估外泌体和Lamp2之间的共定位。在缺氧条件下，共聚焦图像观察到外泌体和Lamp2的共定位显著降低，表明外泌体向内溶酶体的转移减少。将CFSE标记的ADSC来源的外泌体内化，结果显示与EBO处理组和常氧组相比，在低氧孵育期间再循环到培养基中的外泌体蛋白质的存在增加，表明EBO治疗增加外泌体逃避缺氧引起的增强的内吞再循环的潜力，从而促进了治疗性药物在细胞质内的释放（图4）。
图5.生物相容性和止血性能评估。
对于细胞毒性实验，将HDF-a细胞与四种不同浓度的外凝胶、ONB凝胶和EBO凝胶一起孵育24小时。所有组均表现出高细胞活力，这表明它们具有优异的生物相容性。溶血试验中所有水凝胶组都表现出显著的血液相容性。在体外和体内评估EBO凝胶的止血功能，当EBO凝胶与大鼠全血和血细胞混合1分钟时，显示出凝固。在大鼠肝脏出血模型中，出血部位在应用EBO凝胶后被迅速封闭，导致失血量显著减少，这些结果证实了EBO凝胶的有效止血性能，以及伤口愈合特性（图5）。
图6.体外促进增殖、迁移和血管生成。
使用HDF-a细胞评估细胞增殖，更高的BrdU阳性信号和更多的处于S/(G2/M)期的细胞，表明新合成的DNA增加，与其他组相比EBO凝胶组显示出更高数量的增殖细胞。在ADSC-Exos中通过miR-93-3p调节APAF1有助于改善细胞活力和迁移。HDF-a细胞在低氧条件下的迁移能力使用划痕试验和transwell迁移试验来评估，与其他组相比，EBO凝胶治疗组显示出更高的伤口闭合率，表明细胞迁移增强。EBO通过含有Nrf2和FGF2等调节因子的外泌体来帮助血管生成，外泌体促进 β-catenin激活并含有调节血管生成途径的微小RNA(miR-31，miR-125a)，共同增强促血管生成作用。作者使用HUVECs评估体外管形成能力，EBO凝胶处理组产生更多的分支和最大总分支长度，显示了EBO凝胶促进血管生成的潜力（图6）。
图7.体内伤口愈合分析。
在大鼠全层缺损模型中评估了EBO凝胶的伤口愈合性能。与其他组相比，EBO凝胶治疗组表现出显著加快的愈合速度，特别是在从第2天到第10天的增殖阶段。手术后的最初两天观察到体重减轻，可归因于麻醉恢复，随后动物表现出逐渐的体重增加。在14天的治疗后，用EBO凝胶治疗的伤口显示出优异的恢复质量，其特征在于没有肥大性和瘢痕（图7）。
图8.伤口组织病理学分析。
为了全面评估不同治疗的疗效，使用H&E染色和Masson染色对第4天和第14天收集的组织样本进行组织病理学评估，重点关注皮肤修复参数，包括疤痕指数、真皮厚度、表皮厚度和胶原蛋白分数。第4天是愈合过程的炎症和增殖阶段的关键时间窗，而第14天可以反映再生阶段和愈合功效。EBO凝胶组表现出一致的再生表皮、增加的成纤维细胞增殖、增强的血管生成和胶原纤维形成，这突出了EBO凝胶在影响炎症、增殖和愈合早期再生阶段的作用。EBO凝胶处理的组获得最低的疤痕指数，表明更有利的愈合结果。伤口的完全愈合也以真皮的修复为标志，EBO凝胶治疗的组表现出更厚的真皮层，表明更强的愈合过程和良好修复的组织。Masson三色染色显示了EBO凝胶处理组大量密集的胶原纤维，这些纤维表现出更成熟的表型，其特征在于良好组织的排列和复杂的胶原网络拓扑结构（图8）。
总之，作者开发出一种混合水凝胶，它具有止血、抗炎、缓解缺氧和增强外泌体递送的显著能力，当应用于全层伤口时，表现出加速的愈合速度和显著改善的愈合质量。值得注意的是，EBO凝胶还可以潜在地用于糖尿病慢性伤口治疗，利用其供氧能力、抗氧化特性、促进细胞迁移和增强血管形成。未来的研究可以针对其他缺血性疾病，包括慢性伤口和潜在的癌症。
近期，该研究成果以“Exosome-coated oxygen nanobubble-laden hydrogel augments intracellular delivery of exosomes for enhanced wound healing”为题发表于学术期刊《Nature Communications》，论文第一作者为Xiaoxue Han，通讯作者为伊利诺伊医学院 Joseph Irudayarj。
撰稿人：李珂欣
审稿人：胡惠钧
论文全文链接
https://doi.org/10.1038/s41467-024-47696-5
抗菌抗污材料前沿
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