基于钛（Ti）或Ti合金的骨科植入物因其良好的机械和化学稳定性、高耐腐蚀性和生物相容性而广泛用于医疗领域，用于骨组织置换/修复。然而，与其他骨科植入物一样，由于其表面特性和手术引起的因素，它们特别容易受到细菌定植和生物膜形成的影响,形成骨科器械相关感染（ODRI）。抗菌肽（AMP） 是传统抗生素的一种有前途的替代品，因为它们具有广谱活性、低诱导耐药性倾向以及杀死代谢失活细菌的能力。因此，将AMP偶联到植入物表面在生物材料领域起到越来越重要的作用。
此工作通过聚多巴胺层将Dhvar5或MSI78接枝到钛基上，成功获得了两个AMP-Ti表面。两种AMP-Ti都对MRSA具有杀菌作用，在添加人血浆蛋白的培养基中接触6小时即可根除细菌。利用人原代巨噬细胞，通过评估表面诱导抗炎/抗炎（M1/M2）标记物和细胞因子的能力，评估AMP-Ti的免疫调节潜能。AMP都增加了M1标记CCR7和巨噬细胞分泌促炎IL-6和TNF-α细胞因子，特别是对Ti-MSI78表面。此外，两种AMP-Ti表面都具有细胞相容性并促进成骨细胞分化。这项概念验证研究表明，Dhvar5-和MSI78-Ti作为预防ODRI的抗菌涂层具有很高的潜力。
图1. AMP-Ti表面的接触角。
在Ti表面发生多巴胺聚合后观察到WCA显着降低，表明表面亲水性增加，pDA涂层成功（图1）。
图2. AMP-Ti表面的三维形貌。
Ti表面多巴胺聚合后的平均粗糙度（Ra）增加 ，表明pDA涂层的成功。所有AMP-Ti表面的Ra都低于pDA-Ti的Ra，表明存在AMP涂层（图2）。
图3. 钛涂层的XPS 光谱 。
在pDA-Ti表面的XPS谱图中没有检测到与Ti相关的信号，其呈现C 1s、O 1s和额外氮（N 1s）的主峰，证实了沉积在Ti衬底上的pDA层的化学成分至少为10 nm。pDA-Ti样品上的氮含量增加，在 AMP-Ti表面达到最高含量。AMP-Ti上氮的增加清楚地表明pDA-Ti表面存在AMP（图3）。
图4.AMP-Ti 抗菌活性。
抗菌实验表明，固定的Dhvar5和MSI78能够根除MRSA，因为在接触6小时后，这两个表面都杀死了5 × 106 CFU的MRSA。相比之下，CEM4-Ti和pDA-Ti（对照）与Ti表面相比，只导致MRSA活力降低了10倍（图4）。
图5. AMP涂层在pH值为5.8的磷酸盐缓冲液中浸泡24 h后的杀菌性能。
以 Dhvar5作为模型AMP，评估涂层在微酸性条件下的稳定性。结果表明，Dhvar5涂层在缓冲液中孵育24小时后仍保持其抗菌功效（图5）。
图6. AMP-Ti表面对巨噬细胞的免疫调节潜力。
评价用于修饰Ti表面的AMP是否会对人原代单核细胞衍生的巨噬细胞产生影响，结果表明在对照条件下培养的巨噬细胞与在Ti或Ti修饰的表面上培养的巨噬细胞之间没有显着差异。此外，即使肽的浓度高于其最小杀菌浓度，添加到巨噬细胞中的游离AMP也不会影响其活力（图6）。
图7.用鬼笔环肽（肌动蛋白丝染色，红色）和 DAPI（细胞核，蓝色）标记后巨噬细胞形态的代表性图像。
在所有Ti表面上，粘附的巨噬细胞的数量相似，但在M1对照上观察到的细胞数量较少。所有Ti表面的细胞形态都相似，更接近M0对照，除了pDA-Ti外，细胞看起来更细长，更接近M1形态，尽管差异不显著（图7）。
图8. AMP-Ti表面对人巨噬细胞的影响。
为了进一步探索Dhvar5和MSI78-Ti表面的免疫调节潜力，评估了人原代巨噬细胞的M1/M2极化以及促炎（IL6 和 TNF-α）和抗炎（IL-10）介质的巨噬细胞分泌。结果表明，与Ti相比，两种AMP-Ti表面都有促进M2标志物CD163并减少M1标志物CCR7的趋势（图8）。
图 9.AMP-Ti 表面对成骨细胞的影响。
研究了MC3T3细胞是否可以在所有修饰表面分化成骨细胞。在AMP-Ti表面培养14天后，钙量 （Ca2+）沉积物通过测量洗脱的茜素红染色进行定量。结果显示，在pDA和两个AMP-Ti表面存在的情况下，茜素红染色的变化增加了1.5至2倍，与 Ti 相比，Dhvar5 达到统计学显著性。此外，由于细胞外钙沉积物可能与成骨分化相关（图9）。
总之，Dhvar5和MSI78成功地固定在预激活的Ti表面上，获得了一种能够根除MRSA的抗菌涂层，虽然本身不促进巨噬细胞的激活，但可以调节巨噬细胞对LPS和IFN-γ的反应。此外，这些涂层与成骨前细胞相容，促进成骨细胞分化。我们的研究结果支持AMP接枝Ti表面作为一种有前途的有效方法来对抗ODRI。
近期，该研究成果以“Dhvar5- and MSI78-coated titanium are bactericidal against methicillin-resistant Staphylococcus aureus, immunomodulatory and osteogenic”为题发表于学术期刊《Acta Biomaterialia》，论文第一作者为B. Costa，通讯作者为葡萄牙波尔图大学的M.C.L. Martins。
撰稿人：王平
审稿人：韩毅
论文全文链接
https://doi.org/10.1016/j.actbio.2024.11.016
抗菌抗污材料前沿
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