抗生素的过度使用导致了抗生素耐药性（AMR）细菌的出现和传播，虽然目前已经开发出了针对抗生素耐药细菌的新抗生素，但抗菌素细菌的出现已经超过了这些药物的开发速度。面对这些挑战，需要其他方法来对抗耐药菌。
本研究对511个含有不同脂质成分随机组合的LNPs进行了筛选，发现了两个LNPs，LNP 496和LNP 470，它们能有效地将质粒传递到大肠杆菌BW25113中。由于革兰氏阴性菌具有脂质双层，细菌用LNP进行预处理，削弱细菌膜。当在LNP中以10-25mol%存在时，阳离子脂质DOTAP改善了LNP封装的质粒DNA的传递。Cas13a催化非特异性单链RNA裂解活性，导致细菌死亡。LNP封装Cas13a/gRNA表达载体控制临床大肠杆菌菌株感染的小鼠模型，表明LNPs可以作为对抗致病菌感染的药物的传递平台。
图1.用于治疗细菌感染的LNPs的筛选和鉴定。
使用一种新的筛选系统，测试了具有不同脂质组合的不同LNPs将质粒DNA送入细菌的能力。将大肠杆菌BW25113与每个含LNP的质粒孵育，然后将细菌分散在含氨苄西林LB琼脂平板上，选择接收质粒DNA的细菌（图1）。
图2.LNP 470和LNP 496的比较。
利用低温TEM成像和动态光散射（DLS）确定了LNP 496和470的特征。LNP 496和LNP 470表现出正的zeta电位（分别为17.1和20.5 mV）、小尺寸（分别为110.9和134nm）和可接受的多分散性指数（PdI；分别为0.18和0.165）。此外，LNP 470的封装效率（EE，%）为76%，LNP 496为71%（图2）。
图3. LNPs传递给革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌。
评估了LNP 496将质粒传递到其他细菌种类中的效率，表明LNP介导的质粒递送适用于除鼠伤寒沙门氏菌外的其他革兰氏阴性致病菌。LNP 470和LNP 496不影响人上皮细胞系HeLa和人胚胎肾细胞系HEK293T的细胞活力，表明它们对人类细胞几乎没有毒性（图3）。
图4.用LNP封装的pAD123：：INR7质粒治疗感染脓毒症患者大肠杆菌的毛虫。
研究了LNPs是否可以用于预防致病菌引起的感染。为确定脓毒症患者临床分离株的毒力，分别用15株感染梅氏菌，并测定梅氏菌感染后的存活率。在这些分离株中，有12株的毒力高于大肠杆菌BW25113。LNPs被传递给40%的临床分离株（图4）。
图5.LNP介导的CRISPR-Cas13a传递，用于控制由弗格森埃希菌的一种临床分离物引起的感染。
为了抑制细菌生长，使用了CRISPR-Cas13a系统，该系统在gRNA的帮助下识别目标RNA序列，并切割非特异性RNA，导致细菌死亡。还制备了表达Cas13a和Cas13a-gRNA的质粒，以大肠杆菌菌株的16s核糖体RNA为目标，并在LNP496封装后对23号分离株进行处理。LNP 496- Cas13a和LNP 496-Cas13a-gRNA的菌落计数分别为2020和480 CFU/mL，表明Cas13a蛋白的非特异性RNase活性导致了23号分离物的细胞死亡。然后还研究了LNP-Cas13a-gRNA对感染费格森菌23号分离物的小鼠和毛虫存活的影响。当PMB处理细菌，LNPs同时传递编码Cas13a/gRNA的质粒时，毛虫的存活率为40%；在小鼠感染模型中，注射LNP496-Cas13a或LNP496-Cas13a-gRNA后，80 h后的存活率分别为10%和70%（图5）。
本研究为LNPs能够有效地将核酸传递到细菌细胞中，诱导细菌细胞死亡提供了初步证据。然而关于LNPs如何促进质粒传递到细菌中，以及为什么LNP辅助的DNA传递的效率在不同的细菌种类之间有所不同的信息还需要进行进一步研究来确定。总之，本研究为使用LNPs作为控制细菌感染的新工具提供了重要的见解，促进了对新药物传递系统开发的进一步研究。
近期，该研究成果以“Lipid Nanoparticle-Mediated CRISPR-Cas13a Delivery for the Control of Bacterial Infection”为题发表于学术期刊《Advanced Healthcare Materials》，论文第一作者为Bookun Kim，通讯作者为韩国生物科学和生物技术研究所Choong-Min Ryu。
撰稿人：张晓静
审稿人：佘 雨
论文全文链接
https://doi.org/10.1002/adhm.202403281
抗菌抗污材料前沿
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