利用网状纳米结构（通常称为纳米网）捕获细菌，作为一种替代抗粘附的方法引起了人们的关注。在自然界中，诱捕和杀死是一种无处不在的免疫防御机制。为了响应病原体的存在，肽或核酸构建单元从宿主细胞中释放出来，并在溶液中迅速自组装形成纳米纤维，然后交联产生纳米颗粒。这些纳米级结构可以诱捕微生物入侵者，有效抑制其传播并使它们更容易遭受局部分泌的杀微生物剂的攻击。
本文构建了一系列的15至16个残基长的合成β-发夹肽（AMP），这些肽具有自组装成纳米颗粒的能力，能够响应细菌的存在，从而实现对微生物杀死的时空控制。肽序列被合理设计为两个功能模块：（1）发夹结构作为“识别模块”，用于与细菌膜成分相互作用以启动肽构象变化和淀粉样蛋白成核的“识别模块”，以及（2）侧链作为纤颤过程中β-片形成和分子堆叠的“结构模块”。
图1.BTT2纳米网形成由革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌触发。
SEM图像显示纳米纤维的网络只缠结在革兰氏阴性细菌或革兰氏阳性细菌与BTT2（候选菌）孵育的大肠杆菌或金黄色葡萄球菌上。共聚焦图像表明大多数细菌（标记为红色）与肽聚集体（标记为绿色）共定位，证明了纳米网捕获细菌的能力。使用大肠杆菌分离出的LPS（脂多糖）或金黄色葡萄球菌中分离的LTA（脂磷壁酸）诱导出的聚集体与大肠杆菌或金黄色葡萄球菌观察到的纳米网的形态高度相似，证明纳米网形成是由革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌触发（图1）。
图2.多肽纤维化能力的调节。
在BTT1的转角序列处进行了Ala扫描，用Ala替换它的单个残基，增加肽的纤维化能力。SEM图像显示使用BTT-3A与大肠杆菌或金黄色葡萄球菌共孵育时产生纳米网的更多。BTT1-3A纳米网使细菌凝集导致细菌聚集体快速下沉，降低了样品的体积浊度，证明BTT1-3A纳米网具有优异的体外细菌捕获能力（图2）。
图3. 对耐药菌株抗菌活性的调节。
在Ala扫描修改其转位序列的BTT2类似物中，BTT2-2A表现出由LPS和LTA诱导的K114（一种亲淀粉样染料）荧光显著降低，表明BTT2-2A淀粉样蛋白形成减少。在耐药细菌的抗菌活性测试中BTT2-4A的抗菌效果最强。SEM图像显示BTT2-4A与大肠杆菌ATCC 25 922或大肠杆菌M2（具有耐药基因的细菌）共孵育时都成功形成了纳米网。凝集实验显示BTT2-4A导致大肠杆菌M2浊度下降的速度比 ATCC菌株更快，证明可以通过合理设计的序列来调整其抗菌性（图3）。
图4.淀粉样纤维的胰蛋白酶稳定性。
调节胰蛋白酶、肽、LPS添加的顺序去评估胰蛋白酶对蛋白水解降解的稳定性。胰蛋白酶孵育3小时内，预先形成的BTT2原纤维在90-100%的范围内保持一致的K114荧光强度，表明成熟的BTT2原纤维对蛋白水解降解非常稳定。胰蛋白酶孵育3小时后，BTT1-3A和BTT2-3A的K114荧光显著高于BTT2，纤维化的肽比BTT2的稳定性更好（图4）。
图5.纳米网包埋的细菌的活/死染色。
采用的染色方法评估被纳米网捕获的大肠杆菌的活力。共聚焦图像表明BTT2、BTT2-4A 和 BTT1-3A的细菌存活率都有减少，但是BTT1-3A存活的细菌数量最少，证明纳米网对细菌的捕杀能力（图5）。
图6.纳米形成肽的体内抗菌功效和生物安全性。
用小鼠的腹膜炎模型研究纳米网在其体内的疗效。血液生化分析显示，BTT1-3A、BTT2-4A处理和盐水处理小鼠在尿素和肌酐浓度以及ALT（肝功能生物标志物 ）方面没有表现出显著差异，表明BTT1-3A和 BTT2-4A不会对小鼠重要器官造成急性毒性。肾脏组织学图像的显示盐水和BTT1-3A、BTT2-4A处理组之间没有明显变化，证明BTT1-3A和BTT2-4A优异的生物安全性（图6）。
本文成功地设计了在细菌存在下选择性地自组装形成膨胀纳米网的肽。在革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的细胞包膜上，LTA和LPS分别为启动肽淀粉样蛋白形成提供成核位点。并且证明了其临床重要参数，如抗菌活性、纤维化能力和蛋白水解稳定性可以通过合理设计肽序列进行微调。代表性的纳米形成肽在处理后24小时内显示出良好的生物安全性。总的来说，本文的抗菌诱捕-杀伤肽纳米网作为一种替代抗黏附策略显示出良好的临床潜力。
近期，该研究成果以“Bacteria-Responsive Self-Assembly of Antimicrobial Peptide Nanonets for Trap-and-Kill of Antibiotic-Resistant Strains”为题发表于学术期刊《Advanced Functional Materials 》，论文第一作者为Nhan Dai Thien Tram，通讯作者为新加坡国立大学 Pui Lai Rachel Ee。
撰稿人：杨白洪
审稿人：邹开凤
论文全文链接
https://doi.org/10.1002/adfm.202210858
抗菌抗污材料前沿
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