癌症转移占癌症相关死亡的90%以上，是癌症治疗中的一个重大挑战。转移是一个复杂的过程，其中癌细胞从最初的肿瘤部位侵入继发性区域。乳腺癌是女性中最常见的癌症，其癌症死亡率仅次于肺癌。乳腺癌可以转移到主要器官，包括脑和肺，从而大大降低生存结果。癌症转移治疗中常用的方法包括侵入性手术、化疗、 光动力疗法、光热疗法(PTT)和免疫疗法，但它们的治疗效果有限。因此，针对癌细胞的策略(如联合疗法)正在开发中，以提高转移性癌症的治疗效果。
免疫疗法涉及激活免疫细胞来识别和消除肿瘤细胞，并且对正常细胞的副作用低。免疫检查点阻断(ICB)疗法可以减轻T细胞的负调节，包括细胞毒性T淋巴细胞抗原4、程序性细胞死亡1 (PD-1)和程序性死亡配体1 (PD-L1)。抗PD-L1抗体通过与肿瘤细胞上的PD-L1结合并干扰细胞毒性T淋巴细胞的免疫抑制来发挥抗癌作用。在本研究中，作者合成了抗PD-L1抗体Fab，并将其连接到脂质纳米粒（LNPs）的表面。LNP随后用ICG包封。这些含有抗PD-L1 Fab和ICG的LNP被命名为piLNPs，研究了piLNPs在治疗4T1乳腺癌细胞中的功效及其对肿瘤进展、转移和复发提供保护作用的能力。
图1.抗PD-L1 Fab的抗肿瘤效果评价。
为了提高纳米粒的药物释放能力及其在免疫治疗中的应用，作者合成了抗-PD-L1 Ab，它可以附着在LNP的表面。为了提高提取和附着效率，在Fab序列中引入了组氨酸标签。通过抗组氨酸抗体证实了纯分离的抗PD-L1 Fab，并且在Fab中观察到二硫键是完整的。Fab与癌细胞高效结合，且结合水平呈浓度依赖性增加。抗PD-L1 Fab结合被抗PD-L1抗体预处理所抑制，表明Fab和ab的结合位点是相同的。对携带4T1肿瘤的小鼠施用抗PD-L1 Ab和Fab抑制了肿瘤生长。抗PD-L1 Fab治疗充分延迟了小鼠中肿瘤诱导的死亡。抗PD-L1 Fab通过与抗PD-L1 Ab相似的免疫活性表现出抗癌作用（图1）。
图2.piLNP的表征。
掺入抗PD-L1 Fab并用ICG包封的LNPs被用来开发基于NP的光免疫疗法。通过向LNP合成中使用的脂质中添加200μg ICG来合成IGG负载的LNP(iLNPs)，并且ICG的负载效率为90.2±1.3%。使用Ni-NTA 和his-tag的相互作用，将抗PD-L1 Fab连接到iLNPs的表面，所得颗粒被称为piLNPs。TEM在iLNP和piLNP之间没有观察到形状差异，在抗PD-L1 Fab表面附着后，在LNP和iLNPs中观察到的负电荷趋于增加。iLNPs和piLNPs在800纳米波长处显示出高吸光度，在用抗PD-L1 Fab或piLNP预处理后，4T1乳腺癌细胞表达PD-L1水平下降，这表明piLNP与4T1上具有抗PD-L1抗体的表位结合（图2）。
图3. 利用piLNPs对4T1乳腺癌细胞进行光热治疗。
在1.5 W cm-2的NIR激光照射5分钟后，2mg mL-1 piLNPS和iLNPs的温度分别上升至57.9±1.3°C和58.3±1.2°C。用piLNP处理T1乳腺癌细胞，并用1.5 W cm-2的NIR激光照射5分钟，用NIR激光照射处理的piLNP和iLNP显著增加4T1细胞中的凋亡细胞死亡，而未经NIR激光处理的piLNP和iLNP不诱导任何细胞死亡。无论有无激光照射，LNP和LNP +抗PD-L1 Fab都不会导致4T1细胞死亡这表明，在NIR激光照射后，piLNPs和iLNPs可以诱导针对癌细胞的PTT（图3）。
图4.piLNP靶向肿瘤。
4T1乳腺癌细胞在其表面高度表达PD-L1；因此作者研究了piLNPs是否可以靶向小鼠的4T1肿瘤。在iLNPs和piLNPs处理4T1细胞后可以观察到piLNPs在10分钟内迅速附着在4T1细胞表面，随后被细胞吸收。iLNPs在处理10分钟后几乎不粘附到4T1细胞表面，但在处理30分钟后被吸收到细胞内部。4T1发光荷瘤小鼠静脉内注射iLNPs和piLNPs。在小鼠中观察到iLNPs长达12小时，在注射后18小时减少。piLNPs在注射18小时后，在肿瘤周围观察到强荧光。提取外周组织和肿瘤并检测ICG荧光显示，iLNPs仅保留在肝脏中，而piLNPs保留在肾脏、肺、肝脏和肿瘤中，ICG荧光与肿瘤荧光素表达一致。结果表明，piLNPs是靶向小鼠4T1乳腺癌的理想材料（图4）。
图5.piLNP抗4T1肿瘤的PTT研究。
在4T1肿瘤注射后的第6天，小鼠接受静脉注射PBS、LNP、LNP +抗PD-L1 Fab、iLNP或piLNP。注射18小时后，用NIR激光照射肿瘤部位5分钟。与其他组相比，NIR照射导致施用piLNP的小鼠的体温升高更大。激光照射后，进一步监测小鼠，在肿瘤注射后10天，在施用piLNP的小鼠的4T1肿瘤中观察到烧伤伤口。在4T1肿瘤注射后的第28天，经piLNP处理和激光照射的肿瘤在小鼠中完全消失，而其他对照小鼠中的肿瘤继续生长。在施用piLNP并接受NIR激光照射的小鼠中没有观察到肿瘤生长，而在其他对照组中观察到持续的肿瘤生长。除了实现肿瘤完全缓解外，所有piLNP治疗的小鼠都存活，而其他对照小鼠在4T1肿瘤注射后45天内死亡。总之，这些结果表明，通过经PTT联合应用piLNP和NIR激光照射，可以实现4T1乳腺癌的完全缓解（图5）。
图6.piLNPs对肺转移性4T1癌再攻击的保护作用。
在进行抗转移研究之前，作者检测了piLNP是否诱导树突状细胞(DC)激活。在piLNP和NIR激光照射4T1细胞24小时后，收获培养基并用骨髓来源的树突状细胞(BMDCs)处理。在肺转移性4T1-iRFP癌细胞再给药的第22天(第一次4T1肿瘤攻击后67天)，所有对照小鼠死亡，而piLNP介导的小鼠存活至4T1-iRFP细胞再给药的第30天。使用piLNPs成功治愈原发性4T1肿瘤的小鼠表现出健康的肺，而观察到其他对照组的肺有肿瘤浸润。肿瘤的iRFP荧光显示，在对照组中再次攻击后10天，在肺中观察到4T1-iRFP细胞，但是在通过piLNPs治愈的4T1肿瘤的小鼠中没有检测到荧光。H&E染色显示，4T1癌细胞遍布对照组的肺部，而通过piLNP治愈的原发性4T1癌症小鼠的肺部没有显示任何癌细胞浸润。因此，这些发现表明，用piLNP治疗初级4T1的小鼠完全阻断了再次攻击的肺转移4T1癌的生长（图6）。
图7.用piLNP治愈的小鼠引发了4T1抗原特异性T细胞免疫。
在4T1癌症再次攻击后的第16天，收获脾脏并用4T1裂解物刺激24小时。来自通过piLNP治疗治愈了第一个4T1肿瘤的小鼠的脾细胞产生了显著量的针对4T1 Ag的IFN-γ。并且piLNPs治愈最初4T1肿瘤的小鼠中的CD4和CD8 T细胞在细胞内显著增加了IFN-γ和TNF-α的水平，而在其他对照组中这些细胞因子的水平没有变化。通过piLNPs从原发性4T1肿瘤治愈小鼠获得的CD8 T细胞是否对4T1细胞具有侵袭性。在4T1再攻击的第16天，分离CD8 T细胞并与4T1-iRFP细胞共培养。来自PBS-、LNP-、LNP +抗PD-L1 Fab-和iLNP处理的小鼠的CD8 T细胞不攻击4T1-iRFP细胞。piLNPs治愈其初始4T1肿瘤的小鼠的CD8 T细胞侵入并攻击4T1-iRFP细胞。piLNP和NIR激光照射治愈的小鼠显著增加了4T1膜蛋白包被的脾细胞的特异性裂解。这些发现表明，piLNPs的Ag特异性免疫活性可以保护肺转移性4T1癌症的再攻击（图7）。
在这项研究中，作者合成了抗PD-L1 Fab作为癌细胞上免疫检查点PD-L1的抑制剂，以及用于靶向癌细胞。piLNPs中的抗PD-L1 Fab有效地靶向4T1乳腺癌细胞以实现PTT。此外，piLNP的抗PD-L1 Fab提高了免疫治疗的效率，并完全阻断了再攻击的肺转移性4T1癌的生长。piLNP没有任何副作用，它作为多功能纳米药物能够靶向肿瘤，递送药物，并诱导癌症免疫治疗。
近期，该研究成果以“Anti-PD-L1 Antibody Fragment Linked to Tumor-Targeting Lipid Nanoparticle Can Eliminate Cancer and Its Metastasis via Photoimmunotherapy”为题发表于学术期刊《ACS Nano》，论文第一作者为Hae-Bin Park，通讯作者为韩国蔚山大学医学院Peter C. W. Lee和Jun-O Jin。
撰稿人：李珂欣
审稿人：姜 莹
论文全文链接
https://doi.org/10.1021/acsnano.4c08448
抗菌抗污材料前沿
长按二维码关注
获取最新科研消息
