耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌（CR-Kp）细菌对几乎所有可用抗生素具有耐药性，传播速度快，死亡率高，是一个严重的全球卫生问题。CR-Kp特别是ST258谱系和O2afg全球范围内的血浆型O和K疫苗是主要的病毒因子，成为疫苗研发靶标。此研究报告了两种明确的 O 抗原寡糖的化学合成，这些寡糖含有一个或两个类似于 O2afg 血清型的重复单元，以及兔子对 CRM197 聚糖结合物的免疫反应。在急性肺炎的小鼠模型中，还评估了针对 O2afg 血清型聚糖的抗体的被动免疫。
本研究描述了半合成的 O2afg 糖结合疫苗的创建与评估，该疫苗结合载体蛋白 CRM197 ，包含一个或两个重复单元的多糖表位。含两个重复单元的半合成糖缀合物能诱导产生功能性IgG抗体，增强噬菌体杀伤活性和补体介导的CR-Kp伤作用。被动免疫在小鼠急性肺炎模型中表现出保护效果，提示该疫苗可能成为抗菌治疗的替代方案。该疫苗可用于临床开发。
图1.糖缀合疫苗设计及反合成分析获得抗原表位。
肺炎凯布菌O2afg血清型细菌被由d -半乳糖- iii (Gal-III)（→3）-β- d - galf -(1→3)-[α-D-Galp-(1→4)]-α-D-Galp-（1→）重复单元（RUs）组成的多糖覆盖（图1A）。合成了两种低聚糖抗原，模拟天然存在的含有一个RU的三糖(1)和含有两个RU的六糖（图1B），在两种抗原的还原端都有一个氟化的C3氨基烷基连接体，可以有效地与载体蛋白结合并固定在微阵列上。受保护的六糖8是通过将两个具有三糖重复单元结构的构建块（供体9和受体10）组合在一起组装的（图1C）。
图2.人抗体与O2afg血清型合成o抗原结合的测定。
图2A是将合成聚糖1和2固定在CRK-Kp感染患者的玻片和血清上，健康人与抗原孵育。抗体结合用聚糖微阵列法测定，荧光强度表示结合的IgG抗体的数量。图2B显示结合的人IgG抗体对O2afg三糖1（左图）或六糖2（右图）的滴度。两种抗原均显示抗体结合物阳性，但与阴性对照组相比，只有六糖的荧光强度显著增加。
图3. 用CRM197-2免疫的兔子产生识别LPS表位1和2的抗体。
图3A是兔免疫示意图。5只小鼠在第0天接种明矾配制的CRM197-2（每剂量1 μg抗原）免疫，第14天和第28天接种相同配方的强化免疫。长期免疫反应在第133天增强注射后11天测量。阴性对照组3人接受PBS加明矾治疗。图3B是六糖2特异性IgG水平。图3C是三糖1特异性IgG水平。图3D六糖2特异性IgA水平。图3E是针对三糖1的IgA特异性抗体水平。IgA抗体类对于对抗引起呼吸道感染的病原体和人类微生物群的居民很重要，就像肺炎克雷伯菌的情况一样。
图4.流式细胞术检测兔抗o2afg IgG结合及调理噬细胞杀伤活性。
图4A，B是肺炎克雷伯菌O2afg或O1与糖结合物（CRM197-2组，红色）或PBS （PBS组，蓝色）免疫兔血清（稀释1:100）孵育。以含有荧光二抗细菌的阴性对照为参照，建立阳性结合阈值。右图所示的阳性结合定量（MFI）是基于通过荧光阈值的门控事件的百分比和通过阈值的事件的中位数荧光的乘积。图4C−H是用表达荚膜的肺炎克雷伯菌（图4C，D）和无荚膜的突变菌株（图4F，G）对兔血清中存在的抗体的杀伤活性进行了评估。opsonic指数代表50%细菌杀灭的血清稀释度（图4E，H），并基于两次独立检测的血清稀释曲线的四参数线性回归。这里的研究证实了我们的O2afg糖结合疫苗铅诱导产生具有抗噬细胞杀伤活性的抗O2afg抗体，因此具有对抗CRKp感染的巨大潜力。
图5.小鼠肺炎模型的被动免疫。
图5A是小鼠鼻内感染的O2afg-CR-Kp，2h后用合成抗o2afg疫苗（CRM197-2）或PBS疫苗（PBS）接种兔多克隆血清被动免疫。图5B是感染48h后采集肺（左）、BALF（中）和血液（右），通过定量CFU计数分析细菌负荷。这表明本研究中使用的临床CR-Kp分离物对小鼠的侵袭性有限，因此不足以诱导菌血症。图5C是感染CR-Kp 48h后，测定小鼠BALF中髓过氧化物酶（MPO）活性和肺通透性。与未感染的对照组相比，感染小鼠的肺部炎症和水肿增加，证实了急性肺损伤（ALI）的发展（图5D）。但两组间细胞总数无显著差异。虽然与PBS对照相比，抗o2afg多克隆血清没有降低炎症评分或肺泡水肿，但它确实显著改善了感染小鼠的血管周围水肿，达到与未感染动物相当的水平（图5E）。
研究团队开发了一种新型的半合成糖缀合物疫苗，靶向O2afg-CR-Kp，这是解决抗微生物药物耐药性紧迫威胁的重要一步。该疫苗能够诱导保护性免疫反应并克服与传统疫苗方法相关的挑战，这为未来的临床开发和更广泛地应用于耐药病原体带来了希望。
近期，该研究成果以“Semisynthetic Glycoconjugate Vaccine Lead against Klebsiella pneumoniae Serotype O2afg Induces Functional Antibodies and Reduces the Burden of Acute Pneumonia”为题发表于学术期刊《Journal of the American Chemical Society 》，论文第一作者为Dacheng Shen，通讯作者为德国自由大学Peter H. Seeberger。
撰稿人：冉博文
审稿人：李克江
论文全文链接
https://doi.org/10.1021/jacs.4c13972
抗菌抗污材料前沿
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