组织修复是一个高度调节的过程，涉及免疫、基质、血管和实质细胞反应。在愈合过程的不同阶段之间，细胞反应的介质因子起到刺激过渡的作用。组胺是愈合的早期介质，在皮肤中，它由皮肤损伤后驻留细胞（例如肥大细胞）释放，并刺激多个细胞群中的不同反应。组胺信号转导受四种不同的细胞表面G蛋白偶联受体（人类的 HRH1-4，小鼠的 Hrh1-4）的调节，它们在激活时启动不同的下游信号级联反应，但每种受体对组织修复的特异性影响知之甚少。
该团队最近报道了在伤口时单独直接施用组胺或与丝素蛋白-金纳米棒纳米复合敷料一起施用可加速急性和糖尿病小鼠伤口全层切除伤口的闭合。在这里，本研究系统地研究了选择性组胺受体刺激作用对用丝素蛋白基激光激活密封剂（LASE）生物材料密封的切口伤口的影响。
图1.负载吲哚菁绿（ICG）的LASE薄膜的表征。
首先对丝素蛋白脱胶后溶于LiBr溶液中低温透析，去除不溶物后加入吲哚菁绿（ICG），将溶液滴在方形塑料盖玻片上，并在室温下干燥过夜以生成ICG-LASE薄膜。通过动态力学分析（DMA）进行的流变表征表明，该薄膜表现出具有高存储和低损耗模量的弹性特性。ICG-LASE的光热分析表明其具有快速的光热响应性，而没有ICG的LASE对激光照射无反应（图 1）。
图2. 组胺治疗对切口伤口愈合的影响。
通过经表皮水分流失（TEWL）来确定组织愈合效果，TEWL是屏障功能的定量指标，极限拉伸强度（UTS）是生物力学恢复的衡量标准。虽然组胺的递送对TEWL没有显着影响（图 2A），但UTS在早期有显着的增强（图 2B）。盐水和组胺处理的伤口之间大体外观没有变化（图 2C）。这些结果表明，虽然TEWL的恢复不受影响，但外源性组胺给药提高了组织生物力学强度。
图3. 组胺受体在伤口中表达的动力学和选择性对ICG-LASE激光密封后切口伤口愈合的影响。
人和小鼠表达4种组胺受体 （人中为HRH1-4，小鼠中为Hrh1-4）。我们对Balb/c小鼠的皮肤伤口愈合进行了免疫组织化学（IHC），以研究小鼠组胺受体的动力学，并确定了伤口边缘特异性行为，其中Hrh1、Hrh2和Hrh4信号与完整（远端）表皮相比减弱，而Hrh3信号增加。接着评估了LASE介导的切口伤口愈合前的选择性组胺受体刺激（Hrh1-4-ag）作用是否会影响愈合反应。每日TEWL测量表明，Hrh1-ag治疗在切口后前三天显着增加，Hrh2-ag和Hrh4-ag导致切口后第2天和第3天的TEWL降低，而Hrh3-ag第1天的TEWL短暂增加（图 3B）。不同条件下的愈合质量差距不大（图 3C），通过H&E和Masson染色观察组织结构差异（图 3D）。
图4.组胺受体刺激剂对ICG-LASE密封切口免疫反应的影响。
我们通过免疫组织化学染色研究了选择性组胺受体刺激作用是否会影响 LASE 密封切口的免疫反应。我们发现Hrh1、Hrh2和Hrh4刺激愈合伤口中CD86+促炎巨噬细胞显着减少，而Hrh3刺激作用不显着（图 4A、D）。同样，Hrh1和Hrh4刺激愈合伤口中精氨酸酶-1+促消退巨噬细胞显著增加，而Hrh3刺激作用与PBS处理的伤口相比没有影响（图 4B、D）。用Hrh1、Hrh2和 Hrh4刺激治疗的伤口第3天的Ly6G+中性粒细胞数量显着减少，其中Hrh2和Hrh4表现出高效的作用。与对照组相比，Hrh3刺激作用对中性粒细胞水平没有影响（图 4C、D）。
图5.组胺受体刺激作用对小鼠ICG-LASE密封切口非免疫修复反应的影响。
通过量化CD31、PCNA以及E-钙粘蛋白信号中断的角质形成细胞在迁移伤口边缘经历上皮间质转化（EMT）来研究非免疫修复反应（图 5）。Hrh1和Hrh4刺激CD31血管的显著增加，而Hrh2和 Hrh3刺激作用对伤口血管生成没有显着影响（图 5A、D）。我们在切口后第3天观察到各个组胺受体刺激后对增殖都没有影响（图 5B、D）。有趣的是，我们发现与对照组相比，Hrh1刺激E-钙粘蛋白丢失的角质形成细胞显著增加（评估为表皮膜表达中断的细胞），而Hrh2刺激后角质形成细胞显着减少，并有EMT行为（图 5C，D）。
图6.组胺受体及其对角质形成细胞划痕伤口闭合的体外研究。
首先对HaCaT单层的非渗透性培养物进行免疫荧光染色，以可视化每个组胺受体的细胞表面表达，并发现所有四种受体都表达（图 6A）。有趣的是，虽然HRH1和HRH2在人群的大多数细胞中表现出相对均匀的点状分布，但HRH3和HRH4的异质性更强，一些细胞高表达，而另一些细胞低表达。此外，HRH3以点状（低表达）和纤维状（高表达）形态出现。HRH4在细胞的某些区域表现出局灶性富集。细胞迁移实验表明，与未处理的对照相比，组胺和HRH1-ag均显著加速伤口闭合。相反，HRH2-ag在第1天有效且显着地抑制了划痕闭合，并持续到第2天。HRH3-ag和HRH4-ag未表现出加速闭合（图 6B）。
总的来说，我们用光激活密封剂生物材料（LASE）治疗后立即系统地刺激了早期急性反应途径的不同成分。研究结果表明，组胺受体协调复杂的免疫和修复信号反应，涉及愈合的多个方面，包括上皮化、血管生成和免疫调节。因此，选择性靶向单个组胺受体代表了促进伤口愈合和组织修复的潜在方法。组胺能途径的定向激活可能为增强其他组织中生物材料介导的修复提供了机会，例如肠道、脊髓、眼睛、心脏、肝脏等，其中已知增强血管生成、EMT和促消退免疫反应是有益的。
近期，该研究成果以“Histamine Receptor Agonism Differentially Induces Immune and Reparative Healing Responses in Biomaterial-facilitated Tissue Repair”为题发表于学术期刊《Biomaterials》。论文第一作者为Jordan R. Yaron，通讯作者为亚利桑那州立大学的Kaushal Rege。
撰稿人：张志成
审稿人：王 平
论文全文链接
https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2024.122967
抗菌抗污材料前沿
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