抗菌纳米颗粒（NPs）被开发作为传统抗生素的替代品。这些NPs通常具有多种抗菌机制，使它们不易产生耐药性。其中一种主要机制是靶向细菌细胞包膜，这对于维持细胞形状和活力至关重要。一些研究已经量化了NPs与细菌细胞表面的结合动力学。然而，这些研究都是基于细菌具有均匀细胞膜的假设。最近，由于高分辨率成像技术的进步，揭示了各种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的外膜在空间上是高度异质的。细菌细胞膜的不同区域在组成、曲率和功能上差异很大。越来越多的证据表明，细胞膜曲率在驱动脂质和蛋白质在细菌表面的异质分布中起着重要作用。
本文通过研究Janus NPs和大肠杆菌之间的相互作用来检验NPs与细菌细胞膜之间的相互作用。这些“双面”NPs在两个半球上分别显示疏水性和聚阳离子配体。在这里，我们证明Janus NPs优先结合并破坏大肠杆菌膜。通过实验和计算模拟，我们展示了细菌膜的曲率与沿轴向壁的曲率如何影响脂多糖（LPS）的构象，使Janus NPs更有效地穿透LPS层并破坏外膜。
图1.Janus NPs的制备、表征以及与大肠杆菌相互作用。
通过在氨基化二氧化硅NP的半球上涂覆 铬层和金层，然后将十八烷醇偶联到金层上以使其具有疏水性，从而实现了这种Janus结构。然后使用戊二醛交联化学将粘菌素偶联到氨基化半球上形成Janus结构。SEM图片显示，Janus NPs优先与大肠杆菌两端相互作用，并且与Janus NPs接触的绝大多数大肠杆菌在两端表现出变形甚至破裂的细胞包膜。而不含疏水配体的均匀阳离子NP无规律地同时附着在大肠杆菌的两端和轴向细胞壁上（图 1）。
图2. Janus NPs与大肠杆菌相互作用的荧光成像分析。
通过使用活细胞成像直接可视化了Janus NPs与细菌的相互作用。Janus NPs的粘菌素包被半球与微量的Cy5 HNS酯染料偶联，而不会改变其表面化学性质。在活细胞成像过程中，Janus NPs浓度保持在12 pM以实现最佳可视化。通过将NPs的荧光成像与细菌的明场成像相结合，我们观察到Janus NPs优先附着在细菌两端。这种相互作用足够强，即使细菌在溶液中“翻滚”，也能维持NP附着。大约68%的NPs附着在细菌两端，而只有大约18%附着在杆状细菌的轴向膜上（图 2）。
图3. 细菌膜的分子模型和膜曲率对LPS堆积的影响。
我们通过进行了粗粒度（CG）分子动力学（MD）模拟了具有不同曲率的细菌膜：轴向细胞膜的扁平膜和具有高曲率的囊泡。使用LPS的Martini力场CG模型，我们模拟了粗糙（RaLPS）和截短（ReLPS）LPS，其中RaLPS由于更多的糖原而具有更大的体积。为了量化对LPS的曲率效应，我们分析了RaLPS表面覆盖率（%）、糖原密度和 RaLPS分子之间的质心距离（COM）。结果显示，与曲面膜相比，平面膜上的LPS密度明显更高，在这两种情况下，LPS含量越高，密度越高。为了进一步表征RaLPS构象，我们量化了两个参数：RaLPS糖原的回转半径（R_g）以及RaLPS糖原和POPE顶部基团(PO4–) (DPe-S, nm)之间的平均COM距离。结果表明，曲率影响LPS的包装和构象；在弯曲的膜上，LPS采用“蘑菇状”而不是“刷状”结构，暴露出更多的POPE脂质（图 3）。
图4.Janus NPs与平坦和弯曲的细菌膜结合的分子机制。
我们分析了Janus NPs在平面膜和曲面膜上的结合能。Janus NP具有10 nm金核和疏水/亲水半球，直径约为15 nm。我们使用伞型采样模拟来测量自由能与Janus NP和膜之间COM距离的函数。NP的定位是最大限度地发挥疏水和静电相互作用，因为这种配置最好地破坏膜。我们进一步分析了POPE和RaLPS组分的径向分布函数（RDF），以确定结合过程中可能与NP接触的点位。这些发现突出了关于Janus NPs和细菌膜之间相互作用的两个关键点。首先，RaLPS在平面膜上的刷状构象限制了Janus NPs的深度渗透。相比之下，弯曲膜具有密度较低的RaLPS和易暴露的POPE脂质。总体而言，静电和疏水相互作用对于驱动Janus NPs与细菌膜的相互作用至关重要。静电吸引最初使Janus NPs靠近LPS膜，但空间排斥的程度取决于LPS构象，而LPS构象受膜曲率的影响。只有在RaLPS堆积密度较低且空间排斥力降低的高曲率区域，Janus NPs才能通过疏水相互作用有效地附着并破坏LPS层下的脂质膜（图 4）。
图5.Janus NPs与平面和曲面上细菌膜相互作用的三元图。
根据Janus NPs的膜破坏功效，将相图分为三个区域。（i）在POPE含量高但LPS含量低的区域，扁平和弯曲的膜都被Janus NPs破坏。（ii） 在中等LPS水平下，只有弯曲膜被破坏，ReLPS的阈值为60 mol%，RaLPS的阈值为40 mol%，这表明RaLPS由于其体积更大的构象，对与弯曲膜的相互作用的影响更大。（iii）当RaLPS和ReLPS超过80 mol%时，平面和弯曲的膜都不会被 Janus NPs破坏，这可能是因为如此高表面密度的 LPS保护脂质膜免受与NPs的相互作用。该图确定了一系列膜组成，其中Janus NPs可以有效地破坏弯曲膜而不是平面膜。有趣的是，这个确定的范围与在革兰阴性菌中观察到的LPS表面覆盖范围相当（图 5）。
本研究通过揭示一种以前看不见的现象来挑战我们目前对NPs与细菌相互作用的理解，即NPs优先靶向并破坏细菌两端的弯曲膜。重要的是，这项工作挑战了以往抗菌NP研究中统一细菌细胞壁的典型假设。我们证明，高曲率会为抗菌NPs在细菌细胞膜上创造弱点，这是一个以前被忽视的概念。同时，发现抗菌NPs（包括我们研究中检查的NPs）会改变细菌膜的机械性能，这会影响脂质和LPS堆积，从而影响NP-膜相互作用，可能会产生相互作用的反馈回路。鉴于细菌固有细胞壁异质性的新证据，了解其物理、机械和化学异质性如何影响抗菌NPs作用对于开发有效的靶向治疗至关重要。
近期，该研究成果以“Targeting the Weak Spot: Preferential Disruption of Bacterial Poles by Janus Nanoparticles”为题发表于学术期刊《Nano Letters》。论文第一作者为Danh Nguyen，通讯作者为印第安纳大学的Yan Yu和威斯康星大学麦迪逊分校的Ying Li。
撰稿人：张志成
审稿人：王 平
论文全文链接
https://doi.org/10.1021/acs.nanolett.4c04946
抗菌抗污材料前沿
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