呼吸机相关性肺炎（VAP）是发达国家最常见的会威胁生命的医院内感染，占估计发病率的22%，并可导致高达50%的ICU病例。通过气管插管导管（ETT）表面改性来减少ETT生物负荷可能是避免VAP最适合的方法。尽管技术上已经取得了进步，但关于ETT涂层的报道仍然有限。研究已经采用了主动（直接破坏表面微生物定植）、被动（通过改变组成和/或图案来提高抗污染能力）或组合式抗微生物和抗黏附方法，但大多数仅限于研究抗微生物活性和使用安全性。此外，这些研究不足以解决多微生物ETT生物膜问题，这对VAP的发生有重大影响。因此，开发具有广谱抗微生物/抗生物膜活性、生物相容性和成本效益特点的相关材料，可能是下一代ETT的金钥匙，有望预防VAP的发生。
本文基于聚多巴胺（pDA）的功能化，将环丙沙星（CIP）和氯己定（CHX）固定在聚氯乙烯（PVC）表面上。这些表面在物理化学性质方面进行了表征，并用与VAP相关的细菌（铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌）和真菌（白色念珠菌）的单种和多种微生物培养物进行了实验。涂层赋予了PVC表面均匀的形态、不同的润湿性和低粗糙度。通过pDA化学的抗微生物固定通过红外光谱得到证明。涂层表面显示出持续的CIP/CHX释放，保持了长达10天的活性。
图1.扫描电子显微镜的表面形貌图。
裸PVC，即未改性PVC表面，呈现出光滑的形态，且存在一些微孔，可能是由于在生产过程中溶剂的蒸发所致。pDA薄膜在PVC表面的形成，通过表面微孔的消失和自聚合的pDA颗粒的出现得到证实，这些颗粒来源于溶液体积，因此表明存在超分子pDA结构。在CHX和/或CIP存在下的多巴胺聚合相较于裸PVC表面，都使表面呈现出更加均匀的外观，簇状结构分布更为均匀。与单独用CIP功能化的表面相比，CHX涂层的表面覆盖更加完整。增大用于PVC功能化的化合物初始浓度，促使了团聚体数量的明显增加。CHX与CIP共同固定化后得到的表面在形态和覆盖度上与仅包含CHX的表面相似。
图2.表面粗糙度和润湿性。
pDA涂层未显著改变PVC表面的粗糙度，进一步功能化处理CIP和CHX也没有显著影响。一个例外是PVC表面在2 mg/mL浓度下功能化CIP时，粗糙度的参数显著增加（提高了4倍）。在较高浓度下，CIP分子可能由于其结构中的芳香环而自组装并形成聚集体。反过来，CHX在pDA薄膜上的固定化导致表面粗糙度的适度增加，这归因于CHX聚集体的形成以及在接枝的pDA层上出现的多个突起。水接触角显示未改性PVC表面具有疏水性。多巴胺聚合使PVC表面呈现亲水性，CHX在多巴胺聚合过程中引入时，导致水接触角增加，使表面变得更加疏水。另一方面，PVC与CIP功能化并未显著干扰pDA所赋予的亲水性。CHX和CIP共同固定化（CIP/CHX）得到的表面与CHX单独固定化的表面在润湿性上相似。总体而言，无论是单独使用还是联合使用这些化合物，增大初始浓度都会轻微增加改性表面的疏水性。
图3. PVC表面在未功能化和分别与CIP、CHX或CIP/CHX以0.5 mg/mL和2 mg/mL浓度固定化后的ATR-FTIR光谱。
FTIR结果表明多巴胺的成功氧化聚合，pDA沉积到PVC表面。改性表面上保留的特征性pDA吸收峰证明了CIP和CHX的成功负载。
图4.涂层表面的抗微生物释放情况。
CIP在两种浓度下的释放表现出初期的爆发式释放，这一现象发生在CIP固定化到PVC表面后的前24小时。在随后的几天里，CIP无法被检测到（没有CIP质量被释放）。对于功能化较高浓度CIP（2 mg/mL）的PVC表面，也观察到了类似的趋势，不过与低浓度CIP固定化表面相比，释放的CIP量有所增加。与CIP相比，CHX的累计释放质量显著更高，在10天的释放过程中，累计释放量接近40 μg。与CIP类似，CHX的释放量在前24小时内急剧增加，随后在剩余的时间里释放速度减缓。在第4天，所有CIP改性表面均表现出接触抗菌活性，并形成抑菌圈。与仅CIP固定化的表面相比，CIP/CHX联合固定化的表面获得了更大的抑菌圈，强烈表明释放的抗菌剂量更高，这也可以归因于CHX的存在。在10天的释放后，任何改性表面上都没有观察到抑菌圈，但所有CIP、CHX和CIP/CHX改性表面都保持了其接触抗菌活性，证明了抗菌剂的有效固定化和持续的抗菌活性。
图5.细胞毒性。
使用2 mg/mL浓度的CIP或CHX对PVC表面进行功能化处理，未对A549真核细胞产生显著的细胞毒性作用。在PVC表面上以最高抗菌剂浓度（2 mg/mL）进行CIP/CHX共固定化时，活细胞数量下降超过30%，显示出对真核细胞的毒性（<70%的细胞存活率）。研究发现，细胞毒性呈剂量依赖性，最高的抗菌剂浓度（2 mg/mL和1 mg/mL）对A549细胞造成了毒性作用，而CIP/CHX浓度低于0.5 mg/L时，则未对细胞存活率产生影响。
图6.单种生物膜的抗菌效果。（铜绿假单胞菌：P. aeruginosa（A）、鲍曼不动杆菌：A. baumannii（B）、肺炎克雷伯菌：K. pneumoniae（C）、金黄色葡萄球菌：S. aureus（D）、表皮葡萄球菌：S. epidermidis（E）和白色念珠菌：C. albicans（F））。
CHX功能化的表面无法有效防止P. aeruginosa和A. baumannii的生物膜形成，无论施加的CHX初始浓度如何。然而，对于其余的生物膜群体，显著抑制了微生物的定殖。与CHX类似，CIP功能化的PVC表面表现出极好的抑制生物膜形成的能力，并且在大多数情况下呈现剂量依赖性效果。对于K. pneumoniae、S. aureus和S. epidermidis的生物膜，观察到最强的抑制效果，改性表面显著抑制了它们的生长。CIP和CHX的共固定化对所有研究的微生物群体表现出显著的抗生物膜效应。甚至对P. aeruginosa、A. baumannii和C. albicans表现出协同效应。CIP-CHX共固定化在所有微生物群体上的抗生物膜效果超过了单独使用最佳化合物的效果，表明两种化合物联合使用时的效能远超单独使用。
图7.双种生物膜的抗菌效果。（P. aeruginosa和A. baumannii（A）、P. aeruginosa和K. pneumoniae（B）、P. aeruginosa和S. aureus（C）、P. aeruginosa和S. epidermidis（D）、P. aeruginosa和C. albicans（E））。
CHX功能化的表面能够显著干扰所有非P. aeruginosa的群体，将其CFU计数降低到检测下限以下，甚至完全抑制某些细菌物种生长，特别是K. pneumoniae和S. epidermidis。在CIP功能化的表面上，与未改性PVC表面相比，生物膜群体表现出显著的剂量依赖性抑制作用。这些抑制作用在所有菌群中的细菌群体表现得比在真菌群体中更为明显。当CIP与CHX共固定化时，抑制作用更为显著，尤其对P. aeruginosa和A. baumannii群体，效果优于单物种群体。
图8.对三种生物膜的抗菌效果。
所有功能化表面（单独或联合固定化CIP和CHX）显著地影响了S. aureus的粘附。与预期一致，单独CHX功能化的PVC对P. aeruginosa群体没有影响，但当生物膜在CIP或CIP/CHX功能化的表面上形成时，其生长显著受到了干扰，尤其是在CIP/CHX功能化的表面上，P. aeruginosa几乎完全被抑制。然而，对于C. albicans群体，所有涂层的抗生物膜效果未能与细菌群体一样显著，尤其是在三种生物膜的情况下，相比之下，在P. aeruginosa/C. albicans的共培养中，涂层的抗真菌效果更加显著。
图 9. 生物膜的存活情况。
在未涂层PVC和pDA涂层表面上形成的单一物种P. aeruginosa生物膜大部分细胞被绿色染色，表明它们大部分是活的。相反，形成于CIP/CHX修饰表面上的铜绿假单胞菌生物膜显示出绿色染色的活细胞数量明显减少，而红色染色的受损细胞比例显著增高。对由P. aeruginosa、S. aureus和C. albicans共同形成的三物种生物膜的分析结果也相似。当这些生物膜在仅有PVC和pDA涂层表面上生长时，生物膜大部分被绿色染色，表明其具有活性。然而，当三种群体在CIP/CHX涂层表面生长时，其附着性和完整性显著下降，尽管真菌细胞仍保持活性，但细菌细胞数量大幅减少，且红色染色的细胞显示出损伤。
本文设计并实施了一种新的抗微生物材料，以改善ETT表面。采用了多种方法和技术，获取了有关涂层表面的物理化学性质（形态、润湿性、粗糙度、分子组成），并成功实现基于pDA的抗微生物固定化。还可以在降低剂量的情况下实现新型双重药物涂层的抗微生物特性与生物相容性的平衡。将CIP和CHX结合使用，采用多巴胺化学，产生了一种具有广谱抗微生物活性、能够防止微生物黏附并影响复杂（跨种群）多种微生物场景中细胞完整性的双重药物涂层，同时不影响肺上皮细胞的存活。长达10天的持续抗微生物释放证明了双重药物涂层的抗微生物固定化具有长期活性和稳定性。综合发现，双重药物涂层方法在下一代EET中具有巨大的应用潜力，有望降低VAP的发生率。
近期，该研究成果以“Co-immobilization of Ciprofloxacin and Chlorhexidine as a Broad-Spectrum Antimicrobial Dual-Drug Coating for Poly(vinyl chloride) (PVC)-Based Endotracheal Tubes”为题发表于学术期刊《ACS Applied Materials & Interfaces》。论文第一作者为Diana Filipa Alves，通讯作者为米尼奥大学的Susana Patrícia Lopes。
撰稿人：姜 莹
审稿人：胡惠钧
论文全文链接
https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsami.4c01334
抗菌抗污材料前沿
长按二维码关注
获取最新科研消息
