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本文由罗氏集团成员Genentech的科研人员10月23日在线发表于Nature genetics杂志。原文衔接请点击文章最后的阅读原文。

系统性扰动筛选可识别炎症巨噬细胞状态的调节剂以及 TNF mRNA m6A 修饰的作用

文章创新点

1. 使用 CRISPR 筛选的跨物种方法：该研究将小鼠巨噬细胞的全基因组筛选与人类巨噬细胞中关键基因的靶向询问相结合。这种跨物种方法提供了对与人类疾病相关的炎症途径的更广泛和更全面的了解，这在许多以前专注于单一物种的巨噬细胞研究中并不常见。

2. 多模态分析：单细胞 CRISPR 筛选与细胞因子分泌分析相结合，使研究人员能够将转录程序直接与巨噬细胞效应功能联系起来。例如，这项研究从 mRNA m6A 写入复合物中识别出 WTAP 和 ZC3H13 等新型调节剂，展示了它们如何稳定 TNF mRNA 并影响 TNF 的产生，这是一种关键的炎症细胞因子。

3. 发现转录后调控：这项研究强调了 m6A 修饰对 TNF mRNA 稳定性的新作用，展示了这些表观遗传修饰如何作为免疫抑制机制。该研究进一步将影响 TNF mRNA 上 m6A 安装的遗传变异与人类炎症疾病（如囊性肾病）联系起来。

4. 调节回路的功能表征：该研究确定了与关键免疫功能相关的五种不同巨噬细胞状态，例如抗原呈递、髓系募集、炎症细胞因子分泌和载脂蛋白释放。这些发现为塑造炎症和疾病中巨噬细胞行为的调节网络提供了新的见解。

这些创新提供了对炎症巨噬细胞调节的更深入的了解，特别是 m6A 修饰与 TNF 调节之间的新联系，这可能带来治疗见解。

文章解析

背景巨噬细胞作为免疫系统的关键参与者，具有显著的功能可塑性，可根据环境信号在不同的细胞状态之间转换。在慢性炎症条件下，巨噬细胞可以采取持续的炎症状态，从而导致疾病进展。然而，这些炎症状态背后的调节机制仍然不太清楚。本研究旨在利用小鼠和人类巨噬细胞中的系统基因组扰动筛选来揭示控制巨噬细胞炎症状态的调节回路，特别关注 mRNA N6-甲基腺苷 (m6A) 修饰的作用，该修饰与转录后基因调控有关。

技术方法

1. 基于 CRISPR 的功能基因组学筛选：该研究在小鼠骨髓衍生巨噬细胞 (mBMDM) 中采用全基因组 CRISPR-Cas9 敲除筛选，以确定炎症巨噬细胞状态的关键调节因子。随后在人类单核细胞衍生巨噬细胞 (hMDM) 中进行靶向单细胞 CRISPR (scCRISPR) 筛选。

2. 单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq)：在 CRISPR 干扰后，研究人员使用 scRNA-seq 在单细胞水平上分析基因表达的变化，捕获特定基因敲除诱导的转录重编程。

3. 细胞因子分析：为了补充转录数据，该研究包括细胞因子分泌分析，以将基因干扰与巨噬细胞中的功能结果（例如 TNF 产生的变化）直接联系起来。

4. m6A 分析：m6A 增强交联和免疫沉淀 (m6A-eCLIP) 用于识别人类和鼠细胞中 mRNA 转录本（特别是 TNF mRNA）上的特定 m6A 修饰。

结果

1. 巨噬细胞调节回路的识别：全基因组 CRISPR 筛选确定了 37 个基因，分为四个功能类别：mTORC1 信号传导、氧感应、蛋白质泛素化和 m6A mRNA 修饰。这些基因调节不同的巨噬细胞炎症状态。

2. 五种不同的巨噬细胞状态：该研究确定了巨噬细胞中的五种扰动诱导转录程序，与抗原呈递、髓系细胞募集、炎症细胞因子分泌、骨桥蛋白产生和载脂蛋白释放等免疫功能有关。这突出了巨噬细胞在炎症和疾病中的多种功能作用。

3. TNF mRNA 的 m6A 修饰：研究发现，m6A mRNA 书写复合物的关键成分 WTAP 和 ZC3H13 的缺失导致 TNF mRNA 稳定，从而导致 TNF 生成显著增加。这表明 m6A 修饰通过促进 TNF 等炎症转录物的降解，起到免疫抑制机制的作用。

4. 与人类疾病的关联：预计会影响 TNF mRNA 上 m6A 安装的遗传变异与囊性肾病有关，表明 m6A 调节在炎症疾病中发挥着更广泛的作用。

讨论

这项研究为塑造巨噬细胞炎症状态的调节机制提供了新的理解。m6A 修饰控制 TNF mRNA 稳定性和炎症的发现提供了一个新的转录后调控层，可以作为炎症疾病的治疗靶点。该论文还展示了将基因筛查与多模态分析（包括转录组学和细胞因子分泌分析）相结合的价值，以揭示特定基因如何在转录和功能水平上调节巨噬细胞功能。

跨物种方法从小鼠巨噬细胞开始，并在人类巨噬细胞中完善发现，增强了研究结果与人类健康的相关性。此外，m6A 甲基化与 TNF 等炎症转录本稳定之间的联系为针对慢性炎症疾病的表观遗传调控的新治疗开辟了潜在途径。

研究的局限性

1. 细胞类型特异性：该研究重点关注巨噬细胞，虽然研究结果与先天免疫有关，但尚不清楚这些调节机制如何在其他免疫细胞或组织中发挥作用。

2. 单细胞 CRISPR 复杂性：虽然单细胞 CRISPR 筛选功能强大，但其应用仍然受到技术挑战的限制，例如基因编辑效率和分析单细胞实验的大型数据集的复杂性。

3. 体内验证：该研究主要依赖于巨噬细胞的体外模型，目前尚不清楚这些发现如何转化为体内系统，特别是在囊性肾病和慢性炎症等复杂疾病中。

4. 以 TNF 为中心的研究：尽管 TNF 是一种关键的炎症细胞因子，但这项研究主要关注通过 m6A 进行的 TNF 调节。需要进一步研究以了解巨噬细胞中其他炎症介质的调节方式。

本研究提供了关于巨噬细胞炎症状态如何在遗传和表观遗传水平上受到调节的重要见解。确定 TNF mRNA 上的 m6A 修饰是控制 TNF 产生的关键机制，为调节炎症提供了潜在的治疗靶点。这些发现有助于更好地了解慢性炎症的分子基础，并为未来针对免疫细胞中 mRNA 稳定性和表观遗传修饰的治疗干预研究奠定了基础。

类器官在本研究中的应用

本研究使用类器官模拟巨噬细胞衍生的炎症信号对肠上皮细胞的影响方面，有助于证明巨噬细胞扰动对组织完整性的旁分泌作用。

1. 模拟人体组织相互作用：作者使用人类肠道类器官来模拟肠上皮屏障。该模型对于研究巨噬细胞衍生的细胞因子（例如 TNF）如何在炎症条件下影响上皮细胞至关重要。通过将类器官培养物暴露于受 m6A 调节基因（WTAP 和 ZC3H13）干扰的巨噬细胞的条件培养基中，研究人员可以评估巨噬细胞如何影响生理相关系统中上皮屏障的完整性和功能。

2. 评估上皮屏障损伤：类器官实验表明，遗传干扰的巨噬细胞过度产生 TNF 会损伤肠道上皮屏障。研究测量了类器官单层细胞通透性增加和细胞活力降低，这些细胞在暴露于巨噬细胞条件培养基后会有所变化。重要的是，这种损伤可以通过用 TNFRII-Fc 阻断 TNF 活性来挽救，这表明上皮破坏具有 TNF 依赖性。

3. 与炎症性疾病的相关性：类器官的使用使该研究能够模拟上皮功能障碍，这是炎症性肠病 (IBD) 和其他慢性炎症疾病的标志。这强调了巨噬细胞中的 m6A 修饰如何通过控制 TNF 产生对组织产生显著的下游影响，将巨噬细胞中的分子发现与上皮组织中的疾病相关结果联系起来。

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