欢迎关注类器官前言（沿）进展，第一时间了解类器官领域（生物学、癌症生物学、人工智能、材料学、仿生学）的新进展
本文由南加州大学凯克医学院干细胞生物学和再生医学系的科研人员12月2日在线发表于Nature Protocol网站。原文衔接请点击文章最后的阅读原文。
脑类器官的生成和长期培养方法
关键点
功能性人类多能干细胞衍生的人类小脑类器官的生成和长期培养，成功复制胎儿小脑的细胞多样性，以及一些独特的细胞结构特征。
与其他小脑类器官模型不同，这些模型通过单一 SMAD 抑制来启动神经化，并通过 FGF2 向尾部分化，而该方案依赖于双重 SMAD 抑制来促进神经化，并依靠 WNT 和 FGF8b 来促进尾部分化。
介绍
用于研究大脑发育和疾病的人类类器官模型系统的出现，开启了理解早期人类大脑发育中以前无法触及的方面的新时代。鉴于在这些关键阶段人体组织的可用性有限，类器官为深入研究以人类特异性表型和多基因病因为特征的许多神经发育障碍的复杂遗传学提供了一个强大的平台。
能够模拟前脑样区域特征的类器官已被广泛建立、表征和与其内源性对应物进行对比，为前脑发育和疾病提供了宝贵的见解。然而，针对大脑尾部区域的类似努力相对较少。这种差异主要源于外胚层聚集体倾向于产生端脑结构，这自然使得端脑类器官在人类多能干 (hPS) 细胞系内和跨细胞系更具可重复性。然而，非常需要优化和彻底表征其他类型的类器官，包括小脑类器官，特别是考虑到越来越多的证据强调小脑在高阶认知功能中的关键作用。有趣的是，类人猿进化枝内这一大脑区域的大幅进化扩展表明小脑可能在人类特定特征的获得中发挥作用。值得注意的是，研究表明，人类的菱唇具有人类特有的脑室下区，而这种脑室下区在小鼠和其他灵长类动物中并不存在有研究表明，人类Purkinje细胞表现出独特的发育动力学，与其他物种相比，其特点是早产亚型有所扩增。
本文介绍了生成 hPS 细胞衍生的人类小脑类器官 (hCerO) 模型的详细方案。这些类器官能够重现胎儿小脑的复杂细胞多样性，组织成层状层并表现出其体内对应物特有的分子和电生理特征。hCerO 有望增强对人类小脑对大脑发育、功能和疾病的独特贡献的理解。
制备方案
以下方法是基于先前的工作开发的，这些工作确定了峡部组织者的规范线索，峡部组织者是定义中脑/后脑边界的发育神经管的“组织中心”，体内和体外，以及使用脑器官协议改进长期培养技术的策略。该协议涉及三个主要阶段：（1 ）将hPS细胞图案化以类似于峡部组织者的环境，（2）扩大抑制性和兴奋性小脑祖细胞池和（ 3）成熟的小脑神经细胞类型。
第一阶段：建立组织者式的环境
小脑发育由一系列模式化线索启动，这些线索勾勒出中脑/后脑边界的翼状板，小脑的抑制性和兴奋性群体由此产生。对于类器官，为了在 hPS 细胞培养中模拟中脑/后脑边界，第一阶段涉及在无生长因子的化学定义培养基 + 胰岛素 (gfCDM+i) 中将细胞引导至神经外胚层，然后在 CerDM1 中将它们尾部化。先前的研究表明，通过双重 SMAD 抑制可以快速有效地生成神经外胚层，这会抑制转化生长因子-β (TGF-β) 和骨形态发生蛋白 (BMP) 通路。然而，如果没有尾部化因子，hPS 细胞往往会采用类似前脑的身份，正如基础发育生物学研究中观察到的那样5。因此，有必要将细胞暴露于各种形态发生素中，以驱动细胞向尾部分化，最终到达后脑。
发育中的神经管内的关键形态发生梯度调节大脑区域的规范化，包括控制 Wingless/Int-1 (WNT)、音猬因子 (SHH)、骨形态发生蛋白 (BMP)、视黄酸 (RA) 和成纤维细胞生长因子 (FGF) 通路的分子。在过去十年中，已有许多研究旨在生成小脑类器官，这些研究以 Muguruma 等人 2015 年发表的开创性工作为基础。大多数这些方法通过在分化第 2 天施用 FGF2 来启动向小脑命运的尾部分化。然而，该的方法依赖于对 WNT和FGF8信号通路的直接刺激，这已被证明对于体内峡部组织者的规范至关重要。该方法已经成功用于在基于人类细胞的模型中指定中脑和后脑的命运。
WNT 蛋白家族已被确定为神经管内主要的剂量依赖性尾部化因子。因此，使用了典型的 WNT 激动剂 (CHIR-99021) 来促进神经祖细胞的尾部化。此外，峡部组织者具有明确的遗传特征，可通过形态发生调节沿背腹轴和喙尾轴指定邻近的神经外胚层身份。FGF8 在中脑/后脑边界高度表达，与其他信号分子（如 WNT1）一起勾勒出这一边界。FGF8 功能丧失实验导致小脑和顶盖完全丧失，强调了其重要性。因此，为了模拟中脑/后脑边界处相邻峡部组织者的信号提示，这对于生成后脑最前端区域（菱脑节 1）至关重要，将 FGF8 引入到该方案中。
第二阶段：扩大抑制性和兴奋性小脑祖细胞库
在类似峡部组织中心的条件下暴露 16 天后，将类器官转移到 CerDM2 中的 10 厘米振荡培养条件下（以进一步进行神经上皮扩增和成熟。到第 30 天，这些类器官开始产生发育中的小脑的抑制性和兴奋性神经元，这些神经元来源于体外建立的类似峡部组织中心。
第三阶段：小脑神经细胞类型成熟
最后，在 CerDM3 中对类器官进行长期培养（有关培养基成分的详细信息，请参阅“试剂设置”），并决定添加基质细胞衍生因子 1a（SDF1a），这是一种由脑膜释放的趋化剂，有助于引导颗粒细胞祖细胞沿软脑膜表面的切向迁移。虽然对于在 hCerOs 中产生小脑细胞类型的完全多样性并非必不可少，但发现在培养第 30 天至第 60 天之间添加趋化剂 SDF1a 会诱导菱唇祖细胞向类器官外围迁移，从而产生瞬态层状分层结构并全面改善 hCerOs 内的细胞结构。
方法的应用
这里描述的协议可以潜在地应用于广泛的研究，重点是人类小脑发育和疾病。这些类器官已经与人类胎儿大脑进行了基准测试，并被纳入一个综合的人类神经类器官图谱中，揭示了它们在重现人类小脑细胞类型发育方面的高保真度。因此，该系统将使我们能够深入了解其他模型系统无法研究的人类特定特征。例如，hCerOs 提供了一个探索人类菱唇异常发育的平台，菱唇与各种疾病有关，包括 Dandy-Walker 畸形和小脑蚓部发育不全。 hCerOs 中存在人类特异性菱唇脑室下区祖细胞，这为模拟最常见的儿童脑肿瘤髓母细胞瘤提供了机会，最近有研究表明它起源于这个特定的区域 。此外，在 hCerOs 中诱导层状分层的潜力允许跟踪菱形唇衍生物向类器官边缘移动时的迁移，复制小脑发育过程中颗粒细胞祖细胞的切向迁移。这可以更深入地了解这些兴奋性祖细胞的迁移动态，类似于对腹侧前脑的正中神经节隆起 (MGE)、外侧神经节隆起 (LGE) 和尾神经节隆起 (CGE) 的迁移中间神经元进行的广泛研究。此外，该系统有可能更好地模拟人类特有的疾病表型，例如患有毛细血管扩张性共济失调症的患者的Purkinje细胞丢失，这种表型在小鼠疾病模型中没有观察到。此外，通过利用这些功能，hCerO 可以作为一个更强大的平台，进行药物筛选以解决这些表型，并有助于开发更精确、更有针对性的治疗方法。
限制
这些类器官并非没有局限性，这些局限性在人类大脑类器官模型系统中很常见。其中一个局限性是营养和氧气输送不足，这尤其影响类器官的核心，从而限制其生长。此外，周围胚胎组织的缺失会损害细胞组织。为了减轻类器官核心的压力，在培养过程中实施了摇动/生物反应器条件。与前脑类器官不同，前脑类器官由于放射状胶质细胞群的快速扩张而经历显著的尺寸增加，而小脑类器官往往保持相对较小。因此，这导致在皮质类器官中观察到的坏死核心形成较少。
小脑的结构复杂性极高，是其他脑区所无法比拟的。为了解决导致这种高度复杂性的外源性指导线索缺失的问题，将 hCerOs 暴露于 SDF1a 中较长时间，以促进细胞结构组织，这是当前类器官方案中未重现的特征。然而，一旦将 SDF1a 从培养基中移除，hCerOs 内就无法保持层状分层，这表明需要在长期培养中持续供应 SDF1，或者作为替代方案，需要额外的结构或可溶性线索来保持可重复的细胞结构。
小脑类器官的一个独特挑战在于缺乏在发育后期支配小脑的外源性细胞类型，包括两组传入神经元，分别称为爬行纤维和苔藓纤维。爬行纤维仅起源于胚胎第 17 阶段 (E17) 左右的下橄榄核，并在Purkinje细胞树突的近端轴上形成兴奋性突触 ，而苔藓纤维起源于脑桥核/脑干/脊髓，并分别在 E13、E15 和出生后第 0 天 (P0) 支配小脑。通过调节这些小脑传入神经，小脑能够在精细运动控制、感觉运动学习和记忆中发挥重要作用。由于攀爬纤维和苔藓纤维源自发育中的神经管的更尾部区域，因此无法在 hCerO 系统内生成，因此在尝试在体外复制小脑传入回路时，需要采用替代的共培养方法来引入它们。
尽管前脑类器官已经通过诱导或整合人类脑中存在的其他细胞类型（包括少突胶质细胞、小胶质细胞和内皮细胞达到了更高的复杂程度，但这些方法尚未在小脑类器官中尝试过，从而限制了它们在研究发育和疾病方面的潜力。
最后，由于可用的数据集有限，无法进行准确的基准测试，因此按年龄将 hCerOs 与原始人体组织进行匹配是一项挑战。目前，缺乏对各种小脑小叶的深入转录组分析，这与皮质发育的分析不同。虽然目前可以对胎儿数据集进行比较分析，但需要更多关于小脑小叶特征和神经元亚型识别的数据集。
与其他方法的比较
自从 Sasai 实验室发表了一篇开创性的文章概述了一种生成 hCerOs 的方法后，后续研究对此方案进行了调整和改进，从而可以在三维 (3D) 培养中生成小脑组织，这些组织可以在培养中存活更长时间。这些方法中的每一种都利用了 hPS 细胞在 TGF-β 抑制后自组织到小脑祖细胞区的能力，通过高浓度的 FGF2 + 胰岛素68实现神经外胚层特化和尾部化。
与这些方法不同，该方案依赖双 SMAD 抑制剂 (SB43152/Noggin) 和 CHIR-99021（一种 WNT 激活剂）分别促进神经化和尾部化。至关重要的是，在第 4 天使用 FGF8b 指定中脑/后脑边界，重建体内所见的峡部组织中心。该方案与之前的方案的不同之处在于用于神经身份指定的基础培养基的独特配方。在最初 16 天期间优化的基础培养基组成促进了抑制性和兴奋性神经元的发育。此外，分化培养基包括原神经元存活成分和振荡培养条件的独特组合，以增强氧气和营养交换。
30 天后，将类器官转移到无血清培养基中，该培养基含有脂质、肝素和 B27、N2、骨源性神经营养因子 (BDNF) 和三碘甲状腺原氨酸 (T3) 的组合，以延长生长和成熟时间。在此阶段，在添加 SDF1 后，该类器官可重复地表现出空间分离的分层兴奋性和抑制性祖细胞群，这些祖细胞群将持续产生发育中的小脑的主要细胞类型。然而，值得注意的是，在 hCerOs 1中观察到的分层与 Muguruma 等人发表的方案中观察到的相反，在使用不同浓度和时间的 SDF1 后。这表明 SDF1 的时间和浓度在细胞组织中起着关键作用。然而，还需要进一步研究来控制在缺乏体内存在的各种支持细胞类型和指导线索的类器官中细胞结构的正确建立。
虽然尚未对这些方案进行仔细的并排比较，但从已发表的数据来看，仅依靠 FGF2 + 胰岛素的模式化需要小鼠细胞实现Purkinje细胞的成熟，并具有与其体内对应物不同的放电特征。然而，该方案能够在全人系统中使Purkinje细胞成熟，并具有内源性Purkinje细胞的功能特征和典型标记。
方案概述
该方案始于在不依赖饲养层的情况下维持多能干细胞（步骤 1）。在干细胞维持之后，将细胞从培养皿中分离出来，分离并聚集成小球（步骤 2-8），并在各种培养基条件下培养以 (1) 生成峡部组织者（步骤 9-15），(2) 扩增祖细胞（步骤 16-18）和 (3) 使神经元细胞类型成熟（步骤 19 和 20）。一旦生成小脑类器官，将进行下游分析，包括免疫组织化学 (IHC)、单细胞解离以进行转录组分析、钙成像和膜片钳记录，以进行深入的分子和功能表征（步骤 20A-D）。
实验设计
这种分化方案可应用于不依赖饲养层的人类胚胎干细胞 (hES) 和人类诱导多能干 (hiPS) 细胞系。细胞系间变异性是诱导多能干 (iPS) 细胞衍生培养系统的一个众所周知的障碍，因此在本方案中也应予以考虑。这种变异性可能来自细胞系、传代和培养基成分的批次间变异性等因素。为了缓解这些问题，建议充分扩增细胞系，以便在低传代次数（低于 30）下进行所有实验，并尽量减少小分子和培养基补充剂批次间的变异性。此外，当使用患者衍生的细胞系时，建议使用同基因对照细胞系，以限制细胞系变异性，因为细胞系变异性可能会改变类器官中不同细胞类型的比例。
hPS 细胞首先解离为单个细胞，然后在低附着 V 型底板中重新聚集（步骤 1-8）（图1a）。然而，其他板（例如低附着 U 型底板或 AggreWells）也可在市场上买到，并且已用于培养其他 3D 聚集体，但未使用该方案进行测试。hPS 细胞聚集形成胚状体 (EB)，然后同时暴露于选择神经外胚层特征的各种形态发生素，然后暴露于 FGF8b 以指定中脑/后脑边界（步骤 9-15）。在此阶段，培养基成分会影响这些培养物中产生的细胞类型（步骤 11-15）。出乎意料的是，发现在不改变小分子和模式因子混合物的情况下改变基础培养基的配方可以调节区域特性。事实上，如果在分化第 6 天没有切换到 CerDM1，在 gfCDM+i 中培养 16 天的类器官仅会产生小脑兴奋性神经元，如支持性主要论文12中所述。在 96 孔 V 底板中对聚集体进行静态悬浮培养后，将 EB 转移到轨道振荡条件或旋转生物反应器中（步骤 16-20），以帮助类器官内的氧气和营养交换，从而实现长期生长和成熟（图1b）。
hCerOs 的常规分析包括 IHC 分析细胞类型组成（步骤 20A）和钙成像评估功能（步骤 20C）。要进行这些分析，应为每个样本设置一到两个板。这将使 1、2 和 4 个月时对三到六个类器官进行免疫组织化学表征，以及 2 和 6 个月时对五到十个类器官进行功能研究。此外，可以通过单细胞 RNA 测序 (scRNAseq) 对细胞类型异质性和基因表达进行深入分析，其中应处理三个单独或合并的类器官（步骤 20B）。
钙成像研究可以与光遗传学实验相结合，通过将 L7-eOPN3 转导到 hCerOs 中，从而提供一种直接有效的方法来稀疏标记和诱导Purkinje细胞中抑制性视蛋白 (eOPN3) 的选择性表达 (框1 )。此方法可以暂时抑制Purkinje细胞活性。当与 SomaGCaMP6f2 标记和随后的钙分析相结合时，它有助于研究Purkinje细胞对网络的功能贡献。此外，可以使用药物来抑制或激发神经元活动，进一步证实网络中抑制和/或兴奋神经元的参与。
为了获得有关每个细胞的细胞膜特性和动作电位概况的深入信息，可以进行膜片钳记录（步骤 20 D）。光遗传学和膜片钳都需要每个分化批次至少五个 hCerO，每个条件下总共至少需要三个分化。该方案中的功能分析已在活体完整类器官上进行。或者，可以分离 hCerOs 并在塑料或玻璃盖玻片上将细胞培养成单层62。可以使用任何配备有用于延时帧捕获的相机的荧光显微镜对单层培养物进行成像。
往期回顾：
1.Nature重磅！！针对慢性肠道疾病和癌症的治疗策略的一个新的框架
2.肠隐窝的再生调控机制！！Nature Cell Biology
3.乳腺癌中TP53突变细胞 geroconversion（持久肿瘤抑制所必需的状态转换）受损的具体机制---Cancer Cell
4.对骨骼类器官研究的重要启示！！Nature Cell Biology--专门化的动脉后毛细血管促进成人骨骼重塑
微信交流群（请扫描群主二维码，经验证后邀请入群，添加时请注明单位姓名等信息，申请入群群体：投资人，技术与研发人员，科研和医疗机构工作者，企业实控人，高校老师和学生等等一线研究人员）
星球号二维码
