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本文由华盛顿大学药理学系的科研人员10月28日在线发表于Nature methods杂志。原文衔接请点击文章最后的阅读原文。公众号的星球号账号也提供原文下载！！
通过寡核苷酸介导的邻近相互作用组图对 RNA 微环境进行多组学表征
O-MAP在类器官研究中的独特优势
该论文介绍了一种名为**Oligonucleotide-mediated proximity-interactome MAPping (O-MAP)**的新方法，O-MAP方法在类器官研究中特别有价值，具备多项独特功能和优势，可解决研究复杂的三维组织模型中的常见挑战：
三维环境中的高空间精度类器官是三维的类组织结构，其中细胞组织和微环境对再现组织特定生物学过程至关重要。O-MAP允许研究人员在类器官原生空间上下文中直接绘制RNA相互作用，捕捉RNA邻近分子，具有较高的空间精度。
这对于理解类器官细胞结构至关重要，因为该技术保持了类器官细胞层和局部区域内RNA相互作用的组织性。
无需遗传操作的原位标记遗传操作在类器官中较具挑战性，因为类器官通常来源于原代细胞或患者组织，这些细胞比细胞系更难进行基因工程改造。O-MAP依赖于寡核苷酸探针进行RNA靶向，无需转基因标记或复杂的载体递送。
这一优势使O-MAP适用于更广泛的患者来源样本，包括肿瘤类器官和其他临床样本，特别适合需要快速、最小侵入性方案的应用。
样本需求量低类器官通常产生有限的细胞材料，使得高细胞输入技术不太实际。O-MAP的高灵敏度使其可检测传统邻近标记方法少量样本中的RNA相互作用。
这一低样本需求意味着研究人员可以研究更小的类器官、早期发育阶段或稀有患者来源的类器官，同时保持珍贵样本的完整性和可用性。
原位多组学映射类器官用于研究特定组织的基因表达、细胞信号和疾病进展，模拟了类体内组织的环境。O-MAP的多组学能力允许同时分析RNA邻近的蛋白质、转录物和基因组位点，揭示复杂的分子景观。
例如，在癌症类器官中，研究人员可以在原位细胞间相互作用的背景下，绘制推动肿瘤微环境重塑、药物反应或转移的RNA相互作用。
适用于多种样本类型的可移植性类器官类型多样化，包括大脑、肝脏和肿瘤来源的类型，各自需要不同的探针优化或标记条件。O-MAP的适应性设计允许研究人员轻松将方法应用于不同类器官系统，在不同组织类型或疾病模型之间进行比较。
增强RNA驱动的相互作用和局部功能研究RNA在组织形成、细胞分化或疾病病理内的局部功能中起关键作用。O-MAP能够在三维类器官结构中揭示局部RNA相互作用和分子作用，提供如何在类器官模型中探索RNA调控的组织形成和细胞间通讯的新视角。
总而言之，O-MAP为在类器官复杂结构中研究RNA相互作用提供了一种便捷、精确和多功能的工具，使我们在细胞相互作用、发育过程和疾病机制的理解上取得突破性进展。
文章创新点
2. 减少细胞需求
O-MAP具有高灵敏度，只需比传统RNA邻近标记方法少约100倍的细胞量，特别适用于样本量有限的实验室以及低丰度RNA的研究，显著提高了其实用性。
3. 模块化和便携设计
该方法可轻松适用于不同的样本类型（例如细胞系、类器官和固定组织）和不同的靶向RNA。O-MAP的灵活性允许它应用于各种生物学背景和样本制备方法，包括难以进行遗传工程改造的样本。
4. 多组学功能
O-MAP能够同时对RNA微环境进行多组学特征分析，包括RNA邻近的蛋白质、转录组和基因组位点。这种整合方法可以在原位的空间背景下提供RNA相关相互作用的全面视图。
5. 提高信噪比
与APEX等酶标记方法相比，O-MAP基于FISH的靶向技术具有较高特异性，显著降低了背景噪声。这使得空间映射更清晰，为后续分析提供了高质量的数据。
O-MAP方法为原位RNA相互作用组绘制提供了一种简化、成本效益高且通用的选择，极大地扩展了分子生物学和细胞结构研究领域的应用。
文章解析
背景
RNA分子在复杂的微环境中与蛋白质、其他RNA和基因组位点相互作用，发挥着细胞结构和调控的重要作用。了解这些相互作用对于表征RNA功能和亚细胞组织结构至关重要。然而，目前的RNA相互作用组研究方法存在一定的局限性。传统方法依赖于体外技术或需要遗传改造对RNA进行标记，这可能导致背景噪声和非特异性相互作用。该论文提出了一种全新方法O-MAP，通过使用RNA靶向寡核苷酸探针实现原位标记，从而提高了RNA邻近相互作用组绘制的精度和可操作性。
方法
O-MAP通过寡核苷酸探针将生物素化酶直接递送至目标RNA，实现邻近生物素标记。探针附带“着陆垫”序列，后续结合的寡核苷酸探针与辣根过氧化物酶（HRP）连接。当加入生物素-酪氨酸时，HRP催化周围分子的生物素化，从而富集并识别目标RNA附近的蛋白质、转录物或基因组位点。
O-MAP方法的特点包括：
原位应用：O-MAP适用于固定细胞，避免了对活细胞的操作需求。
样本需求量低：O-MAP能够应用于极少量细胞，适合研究稀有或低丰度RNA。
适应性强：O-MAP兼容不同的细胞类型、组织样本和多种RNA目标，适用于多种实验设置。
研究人员利用47S、7SK和Xist等RNA模型验证了O-MAP的有效性，并展示了其在绘制RNA邻近蛋白质组、转录组和染色质相互作用中的效果。关键发现包括：
精度和灵敏度：O-MAP产生高度特异的RNA邻近标记，非特异效应最小。例如，47S RNA的靶向使生物素化集中在核仁区域，而7SK的标记则局限于核斑。
蛋白质邻近谱分析（O-MAP-MS）：O-MAP-MS识别出与每个目标RNA相关的高置信蛋白质组，找出核仁和核斑蛋白，背景噪声极低。
转录邻近谱分析（O-MAP-seq）：O-MAP-seq识别出邻近目标RNA的RNA分子，突出显示丰富的非编码RNA和核仁区域内保留的内含子转录本，及Xist相关RNA参与X染色体失活。
基因组位点邻近谱分析（O-MAP-ChIP）：O-MAP-ChIP捕获了与目标RNA相关的染色质区域，准确映射出核仁相关域（NADs），并识别出Xist和失活X染色体上特定染色质位点的相互作用。
讨论
O-MAP由于其高精度、模块化设计以及对多种目标和样本形式的兼容性，代表了RNA相互作用组绘制的新进展。该方法的适应性和低输入需求使其更加易于操作，扩大了其应用范围，对于没有遗传修饰资源的实验室也十分实用。O-MAP的原位方法使得可以在原生细胞环境中研究RNA相互作用，从而实现RNA邻近分子的高保真度绘制。
O-MAP的多组学功能使研究人员能够同时探索RNA关联的蛋白质组、转录组和基因组数据，为RNA微环境提供了全面的视角。这种整体视图能够揭示新的RNA调控机制，并帮助阐明亚细胞结构的空间组织，为细胞组织和功能研究提供了宝贵的见解。
研究的局限性
RNA标记效率有限：由于酪氨酸化学在标记核酸时效率较低，对于低丰度目标可能需要更多样本量。
依赖固定样本：O-MAP仅限于固定细胞，无法用于活细胞，限制了其在研究动态RNA相互作用中的应用。
染色质非特异标记：尽管较少，但由于生物素自由基扩散，可能会出现少量染色质非特异标记。
优化需求：每个新RNA目标可能需要探针设计的优化与测试，以达到高特异性，这可能会耗费时间。
O-MAP通过提供一种精确、模块化的多组学方法，且无需遗传操作，为现有RNA相互作用组绘制技术带来了显著改进。这一多功能方法有望推进在多种生物系统中对RNA关联相互作用的理解。
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