竹子是世界上最重要的非木材林产品之一。光不仅是植物光合作用最关键的能量来源，还参与调节植物的生物过程。然而，关于蓝光/红光如何影响毛竹的报道却很少。本研究调查了毛竹（Phyllostachys edulis）对蓝光/红光处理的生长状况和生理响应。评估了竹子的生长状况，结果显示蓝光和红光处理均促进了植株高度和整体生长。通过测量气体交换参数、叶绿素荧光和酶活性，评估了毛竹对光处理的光系统响应。此外，与红光处理相比，蓝光处理导致叶绿素含量和酶活性更高。采用串联质谱标签定量蛋白质组学方法，识别了不同光照条件下蛋白质丰度的显著变化，并发现了与特定途径（如光合作用和淀粉代谢）相关的特定响应蛋白。
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前言
毛竹 (Phyllostachys edulis) 是一种广泛种植于中国的竹类植物，以其快速生长和可再生特性而闻名，具有显著的生态价值，如净化空气、减轻噪音和防止土壤侵蚀。研究主要集中在影响其产量的生物和非生物胁迫，包括病害、干旱、土壤盐碱、温度和强光。光不仅是光合作用的能量来源，还在植物生长和发育中起着关键作用。研究表明，红光和蓝光对毛竹幼苗的光形态发生有显著影响，影响根长、节间长和叶宽等生长参数。尽管已有关于光调节的研究，但在蛋白质水平上的分子机制研究仍然有限。蛋白质在生命过程中起着关键作用，近年来，基于质谱的定量蛋白质组学已成为研究的重要工具。本研究采用 TMT（串联质谱标签）技术和 LC−MS/MS（液相色谱串联质谱）对毛竹幼苗在红光和蓝光照射下进行生理和定量蛋白质组学分析，旨在识别与光调节相关的差异丰度蛋白。这项研究将有助于阐明不同光质响应的机制，并为毛竹的实际栽培建立理论框架。植物的生长状态在一定程度上反映了光合积累水平、整体生长健康和对环境胁迫的响应。经过红光处理后，毛竹的叶片开放度增加（图 1a）。在蓝光/红光处理下，植物高度显著增加（图 1a,b），红光和蓝光处理之间没有显著差异。第一节间的长度在初始时相似，但在蓝光/红光处理后显著增加（图 1c）。新鲜重量代表植物细胞的总质量，干重与有机物的积累相关。图 1d 显示，红光处理后毛竹的新鲜重量显著增加（P < 0.0001），而蓝光处理的植物新鲜重量没有显著增加（P > 0.05）。图 1e 显示，红光处理后毛竹的有机物积累高于蓝光处理。不同光质处理后，叶面积显著增加，尤其是在红光下（P < 0.0001），与图 1a 的观察一致。这些变化显著影响了毛竹的高度和干重。![]()
净光合速率表示单位光合面积固定的 CO2 量和单位时间内释放的氧气，是植物光合作用效率的重要指标。在本研究中，毛竹在蓝光/红光处理下的净光合速率保持正值且相似，而对照组的净光合速率为负，表明没有光合作用（图 2a）。气孔是 CO2 和水在植物叶片内外移动的通道，气孔导度表示单位叶面积在单位时间内通过的水量，受光、CO2 浓度、空气温度、湿度和土壤水分等环境因素影响。经过不同光处理后，毛竹的气孔导度显著变化，红光处理的变化更为明显（图 2b）。细胞间 CO2 浓度与净光合速率呈正相关，蓝光/红光处理后，毛竹的细胞间 CO2 浓度明显低于对照组（图 2c）。蒸腾是植物与外部环境之间水分交换的重要过程，红光和蓝光处理的毛竹的蒸腾显著增加，与对照组相比（图 2d）。![]()
在不同光处理下，毛竹的叶片被快速移除并进行 30 分钟的暗处理，使用 ImagingPAM 测定最大光化学效率 Fv/Fm。结果显示，Fv/Fm 值保持在 0.75 到 0.85 之间（图 3a），不同光处理下没有显著差异，表明毛竹在光处理期间未受到光抑制。叶绿素荧光参数Fo表示 Fo 表示 PSII 的主要电子受体完全氧化时的荧光水平，NPQ 反映 PSII 吸收的光子能量中未用于光合电子转移而以热量形式散失的部分，代表毛竹对外部环境的防御机制。NPQ（图 3b）和 Fv/Fo 值（图 3c）在光处理后略有变化，但无显著差异。蓝光处理后毛竹的相对叶绿素含量（SPAD 值）显著高于红光处理（图 3d），表明蓝光处理下的光合能力可能更强。使用显微方法测定不同光处理下的 NAD苹果酸脱氢酶和 NADP苹果酸脱氢酶活性，结果显示蓝光处理后 NADP苹果酸脱氢酶活性保持高水平，而红光处理几乎没有变化（图 3e）。NAD苹果酸脱氢酶在蓝光处理植物中的活性高于红光处理植物（图 3f），表明蓝光处理可能增加了氧化磷酸化和光合作用。总体而言，这些生理指标表明，与红光处理相比，蓝光处理可能导致毛竹的光合和氧化磷酸化水平增加，尽管红光处理也显示出一定的酶活性增加，但不如蓝光处理明显。![]()
在不同光处理下，毛竹的蛋白质水平变化尚不明确，因此采用 TMT 标记的定量蛋白组学方法研究光处理后的蛋白质变化，旨在识别受不同光处理影响的关键通路和蛋白质（图 4a）。共识别到 11,481 种蛋白质，其中 8,693 种被定量（补充表 1）。大部分蛋白质的覆盖率低于 40%（图 S1a），且 92% 的蛋白质唯一肽段不超过 10 个。使用 Proteome Discoverer 2.1 软件进行蛋白质鉴定，质量控制结果显示光谱质量良好（图 S1c,d）。在蓝光条件下，698 种蛋白质显著变化，其中 139 种上调，559 种下调（图 4b，补充表 2），表明蓝光处理对毛竹的影响更强。红光条件下，共有 234 种蛋白质差异表达，98 种上调，136 种下调（图 4b，补充表 2）。蓝光和红光处理下的响应蛋白质分析显示，蓝光特异性变化的蛋白质主要与光合作用相关，而红光特异性变化的蛋白质则与碳水化合物合成和细胞壁生成等生物过程相关（图 4d,e）。进一步的 PPI 网络分析显示，蓝光处理下的相互作用区域主要与光合作用和叶绿素生物合成相关（补充图 2）。共同响应蓝光和红光的 162 种蛋白质中，41 种上调，121 种下调（图 5a,b），上调蛋白质与细胞壁合成相关（图 5c），下调蛋白质与基因表达等生物功能相关（图 5d）。WGCNA 分析显示，蓝光条件下的 787 个基因与光合作用和脂质代谢等通路相关，而红光条件下的 100 个基因与细胞壁组织和大分子降解相关（图 6c,d）。亚细胞定位预测分析显示，蓝光处理下的特异性 DEPs 主要位于细胞核、叶绿体和线粒体等细胞区室（图 6e），而红光处理下的蛋白质则主要位于叶绿体和细胞核等（图 6f）。![]()
以往研究表明，毛竹在 UV 辐射后木质素含量显著下降，且高光照条件下基因表达发生变化，但红光和蓝光对蛋白质表达的影响尚不明确。本研究采用 3 天的暗处理作为对照，发现红光条件下的鲜重和干重略高于蓝光（图 1）。本文评估了多项生理参数，包括净光合速率、气孔导度、细胞间 CO2 浓度等，结果显示蓝光主要影响光系统，而红光则与细胞壁合成相关（图 6c,d）。蓝光处理下的 NADP苹果酸脱氢酶活性较高，表明其在光合作用和能量生产中的代谢响应更强，而红光处理的酶活性增加不如蓝光明显。光信号的调节涉及光受体，红光主要由光敏色素（PhyA 至 PhyE）感知，蓝光则由隐花色素（CRY）和光向性蛋白（phototropins）感知。定量蛋白组学分析显示，蓝光主要影响光合作用和氧化磷酸化通路，而红光则诱导与淀粉和蔗糖代谢相关的蛋白质。蓝光和红光共同上调 41 种蛋白质，且下调 121 种（图 4c, 5a,b），这些上调蛋白质与细胞壁生物合成相关（图 5c）。![]()
WGCNA 分析显示，蓝光条件下的基因与光合作用相关通路高度相关，而红光条件下则与细胞壁组织和代谢过程相关（图 6c,d）。蓝光影响的蛋白质主要定位于叶绿体和线粒体（图 6e），强调了这些细胞器在光响应中的重要性。红光处理下的蛋白质则主要参与细胞壁合成，表明其在碳水化合物利用和细胞结构强化中的作用。![]()
本研究提供了毛竹在蓝光和红光处理下的生长、生理响应和蛋白质变化的全面见解，强调了光在植物生长和发育中的重要作用，并为未来的研究提供了潜在的分子机制和信号通路的探索方向。毛竹种子采自广西桂林，并根据文献的方法进行培养。种子去壳后用双蒸水清洗两次，倒置放置于暗室浸泡48小时。处理后的种子播种于营养土中，并用透明塑料盖覆盖。经过10天后，发芽的毛竹被转移到温室，保持在22°C的温度下，进行16小时光照和8小时黑暗的光周期，持续22天。随后，进行3天的黑暗处理以消除正常光的影响。接着，种子在蓝光或红光下暴露5天，黑暗作为对照，红光和蓝光的强度设定为50 μmol m−2 s−1。测量基本生长指标，包括植物高度、节间长度、鲜重和干重。植物高度从地面到最年轻完全发育叶片的舌部测量（图 1），第一节间长度定义为第二节点到第三节点的距离（图 1）。第二叶片的面积使用 ImageJ 软件测定（图 1）。在处理后，使用便携式光合作用测试仪 Li-6400XT（LI-COR Biosciences, Lincoln, USA）检测毛竹叶片的关键光合作用生理指标，包括净光合速率（μmol CO2 m−2 s−1）、气孔导度（mol H2O m−2 s−1）、细胞间 CO2 浓度（μmol CO2 mol−1）和蒸腾速率（mmol H2O m−2 s−1）。测量时，固定流量模型设定为 500 μmol s−1，干燥剂调整以保持参考相对湿度（RH_R）约为 65%，参考 CO2 浓度设定为 400 μmol mol−1。待仪器稳定后进行测量（图 2）。根据改良方法测定叶绿素含量。新鲜叶片在液氮中研磨成细粉，每个样本与10 mL冰冷的80%丙酮混合，并在4°C的黑暗中孵育过夜。离心后，取1 mL上清液，使用 SPAD Plus（Konica Minolta Investment Ltd., Tokyo, Japan）在646和663 nm波长下测量吸光度，以80%丙酮作为空白对照（图 3）。在蓝光或红光处理后，使用 Imaging-PAM（Heinz Walz GmbH, Effeltrich, Germany）分析毛竹的叶绿素荧光参数。选择健康生长的叶片，在对照（黑暗）、蓝光和红光三种条件下，各随机选取三片叶子，立即在暗室中处理30分钟。仪器首先提供低光以测定初始荧光（Fo），然后使用强脉冲闪光测量最大荧光产量（Fm）和最大光化学量子效率。最后，测定光系统 II（PSII）的最大暗适应光化学效率（Fv/Fm）、潜在活性（Fv/Fo）和非光化学淬灭（NPQ）系数（图 4）。根据 Bohley 等人的方法测定 NAD-苹果酸酶（NAD-ME）和 NADP-苹果酸酶（NADP-ME）的活性。取100 mg 毛竹叶片组织，在冰上匀浆。随后在4°C下以8000g离心约10分钟，记录340 nm处的初始吸光度（A1）和反应1分钟后的吸光度（A2）。最终计算公式为：NAD-ME（nmol/min/g）= (A2 − A1) × 4823 × W（鲜重），NADP-ME（nmol/min/g）= (A2 − A1) × 3215 × W（鲜重）（图 5）。将叶片在液氮中研磨后，在冰上用提取缓冲液（20 mM tris-HCl，pH 8.4，10 mM DTT，8 M 尿素，1% SDS，0.1% 蛋白酶抑制剂）匀浆30分钟，离心去除细胞 debris。向上清液中加入6倍体积的预冷10% TCA-丙酮，置于−20 °C过夜以沉淀蛋白。蛋白沉淀在裂解缓冲液（8 M 尿素，100 mM tris-HCl，pH 8.0，1× 蛋白酶抑制剂混合物）中重溶，并通过 BCA 法（ThermoFisher Scientific, MA, USA）测定。使用过滤辅助样品制备（FASP）方法消化蛋白，样品加载到旋转过滤柱（Nanosep，30 kDa MWCO；Pall, NY, USA），用 DTT 还原后用碘乙酰胺（IAA）烷基化。用50 mM 四乙基溴化铵缓冲液洗涤膜3次以更换裂解缓冲液。蛋白在37 °C下用胰蛋白酶（Promega, WI, USA）以1:50（w/w）的酶-蛋白比消化过夜。用 TMT10Plex 试剂盒（Thermo Scientific, MA, USA）标记消化后的蛋白，黑暗、蓝光和红光处理组样本分别标记为 TMT 通道 126−127C、128N−129N 和 129C−130C。随后，使用高pH反相HPLC系统（U3000 UHPLC，ThermoFisher Scientific, MA, USA）将混合的 TMT 样本分离为12个分馏（图 6）。使用 Orbitrap Fusion 质谱仪（Thermo Scientific, MA, USA）和 Easy nLC 1000 液相色谱系统（Thermo Scientific, MA, USA）分析分馏肽。每个分馏加载1 μg肽于预柱，流速为5 μL/min，然后通过分析柱（NanoEaseTM M/Z HSS C18, 75 μm × 25 cm, Waters）以300 nL/min的流速和120分钟的梯度分离，柱温为50 °C。肽在喷雾电压2.2 kV下电离，随后在数据依赖采集（DDA）模式下进行质谱分析，参数为：MS扫描：质量分辨率60,000，扫描范围m/z 350−1,550，最大注入时间50 ms，AGC目标值4 × 10^5；MS/MS扫描：分辨率60,000，AGC目标8 × 10^4，最大注入时间120 ms，HCD能量38%。动态排除设置为n = 1，动态排除时间为45秒（图 7）。使用 Proteome Discoverer 2.1（Thermo Scientific, MA, USA）和 Scaffold Q+（版本 Scaffold_4.7.1）分析原始数据，蛋白质和肽的假发现率设定为0.01，最小和最大肽长度分别为6和144。采用诱饵数据库搜索生成高（P < 0.01）和中（P < 0.05）置信度肽列表。通过成对比率计算和学生t检验进行蛋白表达差异分析，| Log2 fold change| > 0.585 且 P < 0.01 的蛋白被归类为差异表达蛋白（DEPs）。使用 OmicsBox 软件进行基因本体（GO）富集分析。针对特定光照的 DEPs，使用 STRING 版本 12.0（https://cn.string-db.org/）分析蛋白−蛋白相互作用（PPIs），参考拟南芥（Arabidopsis thaliana）蛋白库。使用 R 包进行加权基因共表达网络分析（WGCNA），并通过在线网站（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）分析亚细胞定位预测。所有统计数据使用 GraphPad Prism 8.0.2（GraphPad Software, San Diego, CA, USA）分析，进行双尾学生t检验的方差分析（ANOVA）。显著性报告符号为：“ns”：P > 0.05，“”：P < 0.05，“”：P < 0.01，“”：P < 0.001，“****”：P < 0.0001，所有数据以均值 ± SEM 报告（图 8）。Zhang C, Tang H, Li T, Wu H, Gu Y, Zhang J, et al. Integrating Physiological Features and Proteomic Analyses Provides New Insights in Blue/Red Light-Treated Moso Bamboo ( Phyllostachys edulis ). J Agric Food Chem. 2024;72:12859–70.
