木质素是次生细胞壁的主要成分，并在多种生物过程中发挥重要作用。在本研究中，在抱秆黄竹？（Bambusa amplexicaulis）和Olyra latifolia中鉴定出了68和42个ABC转运蛋白G亚家族（ABCG）成员，均少于毛竹（Phyllostachys edulis）中的77个。
共线性分析显示，ABCG经历了强烈的纯化选择，功能分化较低。这些ABCG被聚类为两个类群：WBC和PDR。特别是，PeABCG15在竹笋的木质化过程中高度表达。
WGCNA分析揭示了PeABCG15与八个MYB基因共表达，其中PeMYB203能够通过Y1H、DLR和GUS检测激活PeABCG15。此外，在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中过表达PeABCG15显著提高了木质素的含量及木质素单体生物合成基因的表达水平，增强了对外源愈创木醇的耐受能力。
总体而言，我们的发现阐明了PeABCG15在木质素单体运输中的潜在贡献，为理解竹子中的木质素生物合成机制提供了洞察。
ps：monolignol 我翻译为木质素单体，即
对羟基苯乙醇（p-Coumaryl alcohol）
桂皮醇（Cinnamyl alcohol）
香草醇（Coniferyl alcohol
这篇文献我们来看材料与方法，我序号也不改了
材料与方法
2.1 不同竹类物种中ABCG的鉴定和分子特征分析
从竹子基因组数据库下载了Bonia amplexicaulis（六倍）和Olyra latifolia（二倍）的基因组数据。（感觉材料与方法这边写的竹种才是对的，芸香竹和莪莉竹，因为Bambusa amplexicaulis的基因组没公布，但是图注写的又是Bambusa amplexicaulis，所以不纠结这个先）毛竹和水稻（Oryza sativa）中ABCGs的同源序列来自之前的研究（Li et al., 2023）。基于隐马尔可夫模型的域轮廓分析被用来从Pfam（pfam.xfam.org）中检索ABCG转运蛋白（PF00005）。基因家族分析是基于HMM结构，另外使用BLASTp比较竹子中ABCGs的同源序列，结合这两种方法获得B. amplexicaulis和O.latifolia中的ABCG同源候选序列。通过NCBI的CD-Search（www.ncbi.nlm.nih.gov）仔细检查了保守域结构，过滤掉缺乏ABCG特征域的序列。
在不同竹子物种中识别的候选基因根据其基因编号按顺序命名。
另一种命名方法是根据同源序列建系统发育树，按照亲缘关系进行命名，如AtXX01和Ph001010聚在一起，那么Ph001010就是PhXX01，XX就是某基因家族，GFR等。
ProtParam（web.expasy.org/protparam）使我们能够从ABCG序列中获得主要属性的计算推导。使用Plant-mPLoc（www.cs bio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi）和TMHMM v2.0（www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM）分别进行了亚细胞定位和跨膜域的预测。MEME套件（meme-suite.org/tools/meme）用于阐明保守基序结构，TBtools被应用于将基因组映射和域注释整合为示意可视化。同时，使用ESPript 3（espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript）进行深入的序列比对分析。
（1）两种竹子中的ABCG家族基因的序列获取
先得到ABCG家族的同源基因（水稻，毛竹，从前人的文献中）
从pfam数据库中获得ABCG基因家族的保守结构域的HMM模型
使用blastp（基于同源序列）和HMM-search（基于保守结构域）对两竹种的ABCG基因进行查找
2.2 ABCG基因的共线性分析
为了研究竹类谱系中ABCG基因的分子进化，采用MCScanX对毛竹、芸香竹和莪莉竹中的基因进行共线性分析，结合基因组数据提取基因在染色体上的分布，并使用TBtools（Chen et al., 2023）进行可视化。
此外，分别计算了毛竹与芸香竹或莪莉竹之间共线性基因对的非同义（Ka）和同义（Ks）核苷酸替代率。随后，确定了Ka/Ks比率，以作为对这些共线性基因对选择压力的衡量。
2.3 ABCGs的系统发育分析
使用ClustalW对来自毛竹、芸香竹、莪莉竹、水稻和狗尾草的ABCG序列进行了多重序列比对。利用MEGA 11.0构建了系统发育树，采用邻接法（Neighbor-Joining），并使用JTT模型。自助法测试重复进行了1000次，完全删除了缺口和缺失序列。其他选项设置为默认参数。
MEGA软件其实运行效率不怎么好，但是拿来建NJ树是还可以的，我一般选择建ML和BI树，不过这两种算法建树时速度特别慢，特别是序列很多时。听说序列特别多时建ML树可以使用FastTree。
当数据量到达几万条序列时，只有FastTree，NJ和Clearcut有结果。
2.4 PeABCGs 的基因表达谱分析和转录因子结合位点预测
检索了不同高度的竹笋第13节间的顶部、中部和底部的39个样本的转录组数据集（NCBI号：PRJNA673565）。基因的表达丰度通过FPKM（每千碱基每百万片段）进行测量。PeABCGs的表达谱通过TBtools创建的热图进行展示。结合位点是通过PlantRegMap（plantregmap.gao-lab.org/binding_site_prediction.php）在PeABCGs转录起始位点上游1 kb区域内进行扫描的。
2.5 PeABCG15的鉴定、亚细胞定位及共表达网络构建
分别使用TMHMM v2.0和SWISS-MODEL (swissmodel.expasy.org/interactive) 预测PeABCG15的跨膜结构域和三维结构。根据表S1中列出的引物，扩增了不含终止密码子的PeABCG15编码序列，并将其插入到pCAMBIA1300-35S-eGFP载体中CaMV35S启动子的下游。随后，将35S::PeABCG15-eGFP和一个质膜标记基因转染到农杆菌GV3101菌株（Zomanbio, ZK295, 中国）中，并按之前描述的方法（Wang et al., 2017）注射到烟草叶片的下表皮。注射后三天，使用DMi8 S倒置显微镜（Leica, 德国）观察荧光信号。
基于447个转录组数据集，其中381个来自公共数据库，66个来自我们未发表的数据，进行了以PeABCG15为中心的加权基因共表达网络分析（WGCNA）。筛选了在共表达网络中Spearman相关系数大于0.7的共表达转录因子（TFs）。根据已报道的竹类木质化调控网络（Yang et al., 2021），选择了可能具有转录调控作用的TFs。使用Cytoscape 3.10.0可视化该网络。
2.6 酵母单杂交（Y1H）实验
PeMYB203的编码序列被融合到pGADT7-Rec2猎物载体中，包含假定顺式调控元件的PeABCG15启动子区域被克隆到pHIS2诱饵载体中。如之前所述（Li et al., 2021），在酿酒酵母菌株Y187（Zomanbio, ZC1603, 中国）中生成表达配对诱饵和猎物构建体的共转化子，并在SD/-Leu/-Trp（DDO, Coolaber, PM2220, 中国）培养基上进行初步筛选。阳性克隆被转移到补充了60 mM 3-amino-1, 2, 4-triazole（3-AT, Coolaber, SL0930, 中国）的SD/-Leu/-Trp/-His（TDO, Coolaber, PM2150, 中国）培养基上，并在三天后观察生长状态。构建载体所需的引物见表S1。
2.7 双荧光素酶报告（DLR）测定
PeABCG15的启动子区域被插入到pGreenII 0800-LUC中萤火虫荧光素酶（LUC）报告基因的上游，而不含终止密码子的PeMYB203编码序列被克隆到pGreenII 62-SK效应载体中。这些重组构建体被转化到农杆菌GV3101 (pSoup)（Zomanbio, ZC1406, 中国）感受态细胞中，然后注入到烟草（Nicotiana benthamiana）叶片的下表皮。注射后三天，使用化学发光成像系统（Tanon 4800, 中国）检测LUC荧光信号，同时使用双荧光素酶报告试剂盒（Vazyme, DL101-01, 中国）定量LUC和Renilla荧光素酶（REN）活性。
2.8 β-葡萄糖苷酸酶（GUS）测定
GUS染色按照之前的描述进行（Jefferson et al., 1987）。通过将启动子区域克隆到pCAMBIA1391载体的GUS报告基因上游，生成了效应构建体proPeABCG15:GUS，同时将PeMYB203的编码序列克隆到pCAMBIA1300载体中。随后，proPeABCG15:GUS和35S::PeMYB203的构建体分别转化到农杆菌GV3101（Zomanbio, ZK295, 中国）中，并将proPeABCG15:GUS与pCAMBIA1300空载体或35S::PeMYB203一起注入到烟草叶片的下表皮。使用GUS染色试剂盒（Coolaber, SL7160, 中国）可视化组织特异性GUS活性，并通过ELISA（MEIMIAN, MM-121602, 中国）进行比色定量。
2.9 烟草中 PeMYB203 的功能验证和拟南芥中 PeABCG15 的功能验证
将含有35S::PeMYB203构建体或pCAMBIA1300空载体的农杆菌悬液分别注入烟草叶片的下表皮。经过三天后，收获暂时过表达PeMYB203的叶片，以分析与木质素生物合成相关的基因表达。从毛竹的cDNA中分离出PeABCG15的编码序列，并将其插入pCAMBIA1300中，构建pCAMBIA1300PeABCG15植物表达载体。
采用农杆菌介导的花浸转化方法生成稳定的拟南芥转基因株系，具体方法如之前所述（Clough and Bent, 1998）。通过基因分型分析确认来自独立T1转化体的T3纯合系。总RNA从这些株系中分离，并随后合成cDNA以进行PeABCG15转录丰度的RT-qPCR分析。收集来自拟南芥转基因株系和野生型（WT）的花序茎基部相同部位，固定在琼脂糖中，并使用Leica VT1000 S（Leica, USA）切割成50微米的切片。切片用酚溶液染色，并在光学显微镜下观察。通过气相色谱-质谱法分析茎中的单木酚组成（Song et al., 2011）。
此外，将灭菌的拟南芥种子播种在1/2 MS固体培养基上，补充1.5 mmol L-1的香豆醇。幼苗垂直生长，根长在15天后测量。用于阳性植物验证的引物见表S1。
2.10 从毛竹和拟南芥中提取基因组DNA和总RNA，以进行基因克隆和实时定量PCR分析
收集了毛竹、烟草和拟南芥样本，并迅速在液氮中冷冻。使用改良的CTAB方法提取基因组DNA（Gao et al., 2006）。使用TRIcom试剂（Genstone biotech, TR205-D, 中国）分离总RNA，并用DNase I（Zymo research, E1011, 美国）消化RNA样本中的残留DNA。随后，使用PrimeScript RT试剂盒（TaKaRa, 日本）合成cDNA。
根据制造商的说明，使用LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix进行RT-qPCR（Roche, 04887352001, 德国）。分别使用PeTIP41、NbACTIN和AtACTIN作为毛竹、烟草和拟南芥的参考基因（Fan et al., 2013; Xue et al., 2019; Hamel et al., 2024）。RT-qPCR在qTOWER 4.0系统（Analytik Jena, 德国）上进行，每个样本进行三次技术重复。相对表达水平通过2 ΔΔCT算法计算（Livak and Schmittgen, 2001）。RT-qPCR引物见表S1（Xue et al., 2019; Hamel et al., 2024; Ji et al., 2024）。
