生长素响应因子（ARFs）是调控与生长素相关的基因转录的关键转录因子，这些基因在植物代谢活动中发挥着重要作用。对在毛竹中鉴定出的47个PeARF进行了评估，并将其分为三类。结构特征分析显示，内含子数量在3到14之间，而Motif 1、2、7和10具有高度保守性，共同形成了DNA结合和ARF结构域。不同组织的RNA-seq分析揭示，PeARFs表现出组织特异性。此外，PeARFs的启动子中富含丰富的激素响应和应激相关元素，支持了PeARFs的表达在ABA和低温处理下显著被激活或抑制的假设。此外，PeARF41的过表达通过降低半纤维素、纤维素和木质素含量抑制了次生细胞壁（SCW）的形成。此外，预测了一个以PeARF41为核心的共表达网络，其中包含28个基因。酵母单杂交（Y1H）、电泳迁移率分析（EMSA）和双荧光素酶（Dul-LUC）测定结果显示，PeARF41结合PeSME1启动子以抑制其表达。我们得出的结论是，‘PeARF41-PeSME1’调控级联反应介导次生细胞壁的形成。我们的发现为进一步研究PeARFs的作用提供了坚实的理论基础。本文探讨了毛竹（Phyllostachys edulis）在次生壁（SCW）形成中的基因调控机制。毛竹因其优异特性和广泛应用，已成为木材的替代品，其机械特性主要由SCW的组成和含量决定。尽管已有研究集中于SCW形成中的转录因子（TF）及其调控网络（Yang et al., 2021；Wang et al., 2024），但SCW形成的遗传调控机制仍不清楚。
SCW的沉积在细胞伸长完成后开始，主要由纤维素、半纤维素和木质素组成，其中木质素赋予植物细胞刚性（Terrett and Dupree, 2019；Zhong et al., 2019）。在植物中，半纤维素富含木聚糖，合成木聚糖的关键酶为糖基转移酶43家族成员（Jensen et al., 2018；He et al., 2018），而纤维素由纤维素合成酶（CESA）复合体合成（Persson et al., 2007；Polko and Kieber, 2019）。木质素则来源于复杂的酚丙烷生物合成途径，涉及13个酶家族（Vanholme et al., 2010；Barros and Richard, 2019）。
SCW形成受一系列转录因子的分层调控网络控制，这些转录因子直接促进SCW组分的生物合成（Wang and Dixon, 2012；Lin et al., 2017）。在毛竹中，miRNA介导的“MYB-PeLAC20”模块已被建立（Yang et al., 2021），PeMYB26作为正调控因子，促进木质素的积累和木质部的形成。其他转录因子，如WRKY和OsbHLH002，也被证明在SCW生物合成中起关键作用（Hu et al., 2024；Chen et al., 2023）。
此外，植物激素（如细胞分裂素、脱落酸和赤霉素）通过调节结构基因的表达影响SCW形成（Jung et al., 2008；Huang et al., 2015；Liu et al., 2021）。生长素作为诱导次生生长的信号，可能在SCW形成中发挥关键作用（Leyser, 2018）。ARFs（生长素响应因子）是特异于植物的关键转录因子，调控生长素信号通路基因的表达（Quint and Gray, 2006；Zhang et al., 2022）。ARFs通过与Aux/IAA蛋白形成多聚体而受到抑制，生长素浓度超过一定阈值时，Aux/IAA被降解，释放ARFs以调节下游基因的转录（Leyser, 2018；Vain et al., 2019）。
已有证据表明ARFs在植物SCW相关过程中发挥作用，例如PbrARF13抑制梨果实中SCW组分的生物合成（Xu et al., 2023），而GhARF7-1和GhARF7-2则通过与GhERF108结合激活SCW生物合成（Wang et al., 2023）。在毛竹中，ARFs也能在机械弯曲条件下调控木质素合成（Wang et al., 2024）。
本研究识别了毛竹中的ARF家族成员，分析了其基因组结构、系统发育关系及对不同非生物胁迫的响应，并研究了植物激素处理对ARF相关基因表达的影响。最终，识别出PeARF41，可能通过与共表达基因结合参与SCW生物合成。此外，使用酵母单杂交（Y1H）和双荧光素酶（dual-LUC）实验验证了PeARF41及其靶基因的调控机制。综上所述，本文为毛竹ARF家族成员及其在SCW形成中的作用提供了全面的信息。
本研究通过BLASTP分析鉴定出47种毛竹（moso bamboo）ARF（Auxin Response Factor）蛋白，使用22种拟南芥（Arabidopsis）和25种水稻（rice）ARF蛋白作为查询序列。检测到ARF蛋白中存在B3 DNA结合域和AuxRE（Auxin Response Element）域。表S2列出了ARF蛋白的名称、氨基酸数、分子量、理论等电点、GRAVY（大平均亲水性）值和亚细胞定位。PeARFs编码的蛋白质氨基酸数从385个（PeARF38）到1139个（PeARF7）不等，分子量范围为44.24至126.37 kDa。稳定性指数均大于40，表明所有PeARFs均为不稳定蛋白。GRAVY值为负，显示出亲水性特征。此外，亚细胞定位预测结果显示所有PeARFs均位于细胞核中。为验证ARF（Auxin Response Factor）家族成员的进化特征，本文构建了包含94种ARF蛋白的系统发育树，其中包括47种来自毛竹（moso bamboo）、22种来自水稻（rice）和25种来自拟南芥（Arabidopsis thaliana）（图1）。结果表明，这些ARF蛋白可分为三类（Class Ia–c、Class II和Class III）。其中，Class II为最大类，共有32种ARF蛋白；Class III则包含三种拟南芥、六种水稻和十种毛竹ARF蛋白，可能具有相似功能。此外，十二种PeARFs与拟南芥的ARF蛋白和八种水稻ARF蛋白分别归属于相同亚群（Class Ia和Ic），而Class Ic仅包含拟南芥的ARF蛋白。研究还发现，毛竹和水稻的ARF蛋白之间的关系比任一者与拟南芥的关系更为密切。PeARFs（Auxin Response Factor）基因的特征结构如图S1A所示，包括外显子、内含子和非翻译区（UTR）的数量和分布。PeARFs包含3至14个外显子，其中Class I和Class II的外显子数量为12至14个，而Class III仅包含三个外显子，PeARF35除外（图S1A）。同类PeARFs具有相同的外显子数量和长度，但在同一类群内，PeARFs的长度有所不同，如PeARF02、PeARF05、PeARF08、PeARF13、PeARF36、PeARF40和PeARF43。为进一步研究PeARFs的结构特征，本文使用MEME工具识别了10个保守基序。分析结果显示，基序1和基序2在所有PeARFs中均存在，而基序7和基序10则在除PeARF01、PeARF35和PeARF38外的所有PeARFs中存在（图S1B）。总体而言，同一亚群的成员共享相似的基序组成，且不同亚群的PeARFs之间在基序组成上没有显著差异。其中，基序1属于B3 DNA结合域（DBD），基序2、基序7和基序10属于ARF域（图S1C）。尽管大多数PeARFs中的基序排列一致，但也观察到某些基序的重复现象，例如PeARF07、PeARF11、PeARF23、PeARF20、PeARF32和PeARF33中的额外基序6。这些重复基序的存在表明它们在介导特定功能中起着关键作用。ARF（Auxin Response Factor）基因在特定组织中的表达与其功能相关。本文基于先前的转录组数据，采用FPKM方法确定了47种PeARFs在不同竹子组织中的表达模式（图2）。根据基因表达水平的特征，这47种PeARFs被分为五个不同的组（组I–IV），每组在组织水平上表现出显著的差异。组IV包含19种PeARFs，在幼嫩组织中高表达；在0.2米的茎和茎的中下部没有显著差异，但在芽和茎的顶部表达水平较高。组I的基因在老茎中的表达普遍较低，但在0.2米的茎中表现出显著表达。组II的PeARFs在根部的表达水平高于其他组织，而在老茎中的表达水平相对较低（图2）。此外，大多数同源基因对表现出相似的组织特异性表达模式，但也存在一些例外。例如，PeARF35主要在芽中表达，而其同源基因PeARF01则特异性地在1.5米的茎和芽中表达。本文对PeARF（Auxin Response Factor）启动子进行分离和顺式元件分析，以识别不同的生物功能（图3）。分析结果显示，47种PeARFs启动子中存在1043个顺式元件，涵盖17种不同的顺式元件。这些元件可分为两大功能组：植物激素响应和生物/非生物胁迫响应。除PeARF31外，所有PeARFs的启动子均至少包含一个与脱落酸（ABA）响应相关的ABRE盒。与茉莉酸甲酯（MeJA）响应相关的特定元素（CGTCA和TGACG基序）在PeARFs中广泛分布，且在各PeARF中分布相似。此外，识别出五种与生物和非生物胁迫响应相关的顺式元件，其中MYB和MYC元素占比最高，分别出现在45和46种PeARFs的启动子中。某些PeARFs的启动子区域还包含与生长相关的顺式元件，如CAT-box（与分生组织表达相关的顺式调控元件）和生物节律元件，而PeARF41的启动子区域包含CAT-box顺式调控元件（表S3）。这些结果表明，PeARFs在环境胁迫相关功能中发挥特定作用。在PeARFs（Auxin Response Factor）的启动子中发现了丰富的与低温和脱落酸（ABA）相关的顺式元件，表明这些PeARFs可能参与对低温和ABA的响应。因此，本文评估了在低温和ABA处理下，毛竹植物中PeARFs的转录水平。qPCR结果显示，大多数PeARFs在低温胁迫下的表达水平先上调后下调，唯有PeARF33和PeARF43的表达持续上调，而PeARF06则表现为下调（图4）。为进一步确认ABA对PeARF丰度的影响，使用qPCR检测了这些基因的表达。结果显示，20种PeARFs显著变化，表现出两种不同的表达模式：初期上升后下降，且在处理持续时间内急剧下降（图S2）。特别是在6小时和12小时的处理下，PeARFs的表达显著下调，相比于0小时下降超过50倍，PeARF29除外。此外，PeARFs在IAA处理下的表达模式也显示出相似的趋势（图S3）。总体而言，这些结果表明某些PeARFs对不同处理表现出有效的响应。为阐明PeARFs（Auxin Response Factor）在次生壁（SCW）形成中的生理作用，本文使用qPCR测定了十二种PeARFs在不同高度芽中的表达模式。PeARFs表现出三种不同的表达趋势：持续上升、上升后下降，以及初期下降后随时间稍微稳定或上升（图5）。相关性分析显示，PeARF41与木质素含量呈现最高的负相关（0.987，p值<0.01；表S4）。此外，PeARF41与在杨树中负调控木质素生物合成的PtrARF2.1同源（图S4）（Fu et al., 2019）。为验证PeARF41的功能，生成了过表达PeARF41的转基因水稻。三条植物线（OE-6、OE-7和OE-10）经RT-qPCR确认其PeARF41表达水平较高（图S5）。进一步分析发现，PeARF41过表达的植物在植物高度上表现出更好的表型，相较于野生型（WT）植物（图6A），同时木质素、半纤维素和纤维素的含量及生物量均显著降低（图6B–D；图S6）。已知OsCESA4、OsCESA7和OsCESA9为水稻中与SCW形成相关的CESA复合体（Tanaka et al., 2003），而PAL、4CL和CAD家族基因则参与木质素生物合成，与SCW形成密切相关（Shin et al., 2023）。因此，使用qPCR检测了PeARF41过表达对转基因水稻与WT水稻中这些基因转录水平的影响，结果显示OsCESA4、OsCESA7、OsCESA9、OsPAL1、OsPAL5、Os4CL3、OsCAD1和OsCAD2在转基因水稻中显著下调（图6E–L）。PeARF41的亚细胞定位及其在抑制SCW相关基因PeSME1表达中的功能为了分析PeARF41（Auxin Response Factor 41）的亚细胞定位，本文将融合构建体（35S-PeARF41-GFP）和空载体（35S-GFP）瞬时转化至烟草（N. benthamiana）中，利用共聚焦显微镜观察GFP信号。结果显示，空载体的绿色荧光分布在质膜或细胞核上，而35S-PeARF41-GFP仅在细胞核中发出荧光，表明PeARF41定位于细胞核（图7A）。为进一步验证PeARF41在调控次生壁（SCW）形成中的潜在分子机制，预测了以PeARF41为中心的共表达网络，结果显示PeARF41与28个基因共表达（图7B），其中一个基因被识别为与SCW相关的NAC转录因子（PeSME1）。
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为确认PeARF41与PeSME1之间的调控关系，进行了Y1H、EMSA和双荧光素酶（dual-LUC）实验。在Y1H实验中，将PeARF41与PeSME1启动子及ARF结合位点共同转化至Y187酵母株中，结果表明PeARF41能够结合PeSME1启动子（图7C和D）。EMSA结果显示，PeARF41可以结合PeSME1启动子的ARF结合位点，且该结合可被突变探针有效竞争（图7E）。在双荧光素酶实验中，效应子构建体与报告构建体共同转化至烟草叶片中，结果显示共转化样品的LUC活性低于仅转化报告构建体的样品，表明PeARF41抑制了PeSME1的表达（图7F和G）。因此，Y1H和双荧光素酶实验表明，PeARF41通过结合PeSME1启动子抑制其表达。这些功能和生化验证实验初步勾画出“PeARF41-PeSME1”级联反应，抑制木质素和纤维素的合成（图S7）。
本文在毛竹基因组中鉴定出47种PeARFs（Auxin Response Factors），构成一个较大的转录因子家族，数量显著高于其他植物，如水稻（Oryza sativa，25个）、拟南芥（Arabidopsis，22个）和杨树（Populus trichocarpa，39个）（Wang et al., 2007；Kalluri et al., 2007），这表明PeARF家族可能经历了基因扩增事件。ARF基因数量的变化可能与基因重复事件或基因组大小有关。PeARFs的基因长度、预测的蛋白质分子量和等电点存在广泛变异，但各亚群成员在基因结构和功能域上表现出相似性（图1；图S1）。它们在内含子-外显子排列模式上也极为相似，特别是在内含子和外显子的数量方面，表明这些PeARFs在进化上较为接近，可能在相同的生物过程中发挥作用，这一点在以往研究中得到了验证（Arpita et al., 2023；Chen et al., 2023）。然而，某些亚群中也发现了例外现象，可能表明在进化过程中发生了外显子重组和剪接或基因片段的插入（Kolkman and Stemmer, 2001；Staiger and Brown, 2013）。例如，Class III中的PeARF35仅有一个外显子，而其他Class III成员有两个外显子，表明这些蛋白可能具有新的功能（图S1A）。此外，PeARF家族成员在ARF基因数量上的变异可能与基序数量和排列的保守性及多样性相关，进一步支持其功能的多样性（图S1B）。本文研究表明，PeARFs（Auxin Response Factors）具有高度保守和组织特异性的基因表达模式，这与其保守和多样化的结构有关。II类和III类的PeARFs在多个器官中广泛表达，表明这些PeARFs可能在竹子的生长和发育中调控不同器官的形态发生。其中，II类PeARFs在根部高表达，而III类PeARFs在芽尖高表达，提示结构相似的基因可能具有相似的功能。然而，同一亚群内成员的表达模式并不总是保守。例如，尽管PeARF05、PeARF08、PeARF11、PeARF12和PeARF31聚类在同一亚群中，但其表达模式明显不同。PeARF47在0.1 cm的根部及中下部芽尖高表达，而其他基因则在芽尖和芽的顶部高表达。此外，某些单系群的PeARFs表现出与其他单系群不同的表达模式，例如I类亚群中一些基因在所有研究组织和阶段中高表达，而另一些则低表达。这些结果表明，这些基因组可能在相同的生物过程中发挥相反或拮抗的功能，或在不同情况下扮演不同角色。分析还揭示了PeARF基因在不同亚群中的表达谱，在亚家族内较为保守，而在亚家族间高度多样化，尽管存在少数例外。这一新见解将为未来的基因功能研究提供有益的参考。本文指出，生长素（Auxins）作为重要的植物激素，在植物生长发育的多种生物过程中发挥关键作用（de Roij et al., 2024）。生长素介导植物对不同生物和非生物胁迫的反应，而ARFs（Auxin Response Factors）在生长素信号转导中具有重要的调控功能。研究表明，GmARF16通过miR160a–GmARF16–GmMYC2模块赋予转基因大豆盐碱耐受性（Wang et al., 2024），而CsARF5在黄瓜低温胁迫中也发挥重要作用（B Zhang et al., 2021）。
qPCR结果显示，若干PeARFs在冷胁迫下的表达水平显著增加（图4）。从PeARFs的启动子区域进一步分离出多种与非生物胁迫响应相关的潜在元件（如LTR、MYB和MYC基序），这表明它们在不利环境条件下可能发挥重要作用（图3）。启动子的顺式元件与许多遗传因子结合，从而调控各种生物过程，包括对外源植物激素处理的反应。PeARFs的启动子中识别出许多与ABA（脱落酸）反应相关的元件（图3），同时qPCR分析确认，PeARFs的转录水平在ABA处理下显著上调（图S2），与以往研究一致（Li et al., 2020；Liu et al., 2023）。这些PeARFs可能是毛竹中介导非生物胁迫反应的ABA依赖信号通路的重要参与者。
本文综述了ARF（Auxin Response Factor）蛋白的功能多样性，包括其在侧根形成（Ebstrup et al., 2024；Kirolinko et al., 2024）、种子休眠（Duan et al., 2024）、荔枝果实脱落（Ma et al., 2024）及辣椒生长与免疫之间的权衡（Cai et al., 2024）中的作用。重要的是，已有研究表明ARFs通过结合顺式元件（如AC和AuxRE样元件）调控次生壁（SCW）形成（Wang et al., 2024）。例如，ARF8.4的过表达可激活MYB26和AUX/IAA19，从而调控内皮层的木质化（Ghelli et al., 2018）。Aux/IAA9-ARF5模块直接调节HD-ZIP的转录水平以影响SCW形成（Xu et al., 2019），而在杨树中，PtrARF2.1被识别为参与木质素生物合成的调控因子（Fu et al., 2019）。此外，GhARF7-2有效结合GhMYBL1的启动子以激活其表达，从而调控SCW生物合成（Wang et al., 2023）。
在本研究中，PeARF41通过调节木质素、纤维素和半纤维素的生物合成抑制SCW形成，且通过三条OE-ARF41转基因水稻的表型验证了这一功能（图6）。转基因水稻之间的表型不一致性与PeARF41的不同表达水平有关。此外，苯丙氨酸代谢途径对SCW形成至关重要，NAC转录因子（TFs）在该途径中起关键调控作用（Cao et al., 2023）。特别是，作为一组NAC TFs，SMBs通过转激活SCW相关基因在木质部和导管相关细胞中诱导异位SCW沉积（Ohtani et al., 2011；Akiyoshi et al., 2021）。
本研究中，识别出的SME转录因子（PeSME1）通过共表达网络作为PeARF41与SCW形成相关基因之间的桥梁（图6和图7）。此外，SCW相关的NACs（如NSTs和SNDs）有效调控多个下游因子，如MYB46和MYB83，从而可能调控SCW形成相关基因（Yamaguchi et al., 2011）。NACs能够直接结合下游SCW相关酶编码基因以调节转录水平（Liu et al., 2021）。因此，这些调控关系值得进一步研究。总体而言，生化实验表明PeARF41通过“PeARF41–PeSME1”级联参与SCW生物合成的调控。
在这项研究中，我们系统性识别了47个毛竹PeARF基因。尽管PeARF编码的蛋白质中存在保守的基序，但在不同的毛竹组织中，多种PeARF表现出特定的时间和空间表达模式。在冷胁迫和ABA胁迫下，几种PeARF的表达呈现差异，这表明这些基因可能在非生物胁迫响应中发挥关键作用。特别是，进一步的生化实验和转基因水稻分析揭示，PeARF41通过“PeARF41–PeSME1”级联负向调控次生细胞壁形成。Kebin Yang; Huiling Zhang; Letong Sun; Yue Zhang; Zhimin Gao; Xinzhang Song. Identification and Characterization of the Auxin-Response Factor Family in Moso Bamboo Reveals That PeARF41 Negatively Regulates Second Cell Wall Formation. Plant Physiology and Biochemistry，2025,219, 109395, doi:10.1016/j.plaphy.2024.109395.
