棉籽的综合利用受到色素腺存在及其所含的包合棉酚（inclusion gossypol）的限制。理想的棉花应具有无腺籽但为有腺植物的特性，这一特征仅在少数几种澳大利亚野生棉花物种中找到，包括Gossypium bickii（一种棉花）。将这一特征转入栽培种已被证明是困难的。理解色素腺形态发生的生物过程及其相关的分子机制，将有助于培育具有无腺棉籽和其他组织中有色素腺的栽培棉花品种。
在本研究中，我们对48小时浸泡后从G. bickii种子子叶中分离的12222个原生质体进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq）。这些细胞在无监督的情况下被聚类为14个不同的簇，借助已知细胞标志基因，这些细胞可以被分为八个细胞群体。色素腺细胞与其他细胞很好地分开，并能够进一步细分为色素腺实质细胞、分泌细胞和凋亡细胞。
通过整合色素腺细胞发育轨迹、转录因子调控网络和核心转录因子的功能验证，我们建立了一个色素腺形成模型。在该模型中，光照和赤霉素被验证促进色素腺的形成。此外，发现三个新基因GbiERF114（乙烯反应因子114）、GbiZAT11（拟南芥锌指蛋白11）和GbiNTL9（NAC转录因子样蛋白9）影响色素腺的形成。综合这些发现为色素腺形态发生提供了新的见解，并为未来的棉花单细胞RNA测序研究奠定了基础。
前言
本文探讨了棉花（Gossypium spp.）作为全球主要天然纤维作物的潜力，指出棉籽富含高质量的蛋白质（23%）和油脂（21%），但由于含有棉子酚（gossypol）的色素腺（pigment glands），其利用受到限制。棉子酚是一种黄色萜类化合物，有助于棉花抵抗昆虫和病原体，因此理想的棉花应在棉籽中无色素腺，而在其他组织中有色素腺。
为此，理解色素腺形成和棉子酚生物合成的发育过程及其分子机制至关重要。色素腺在大多数棉花组织中呈现为黑色不透明点，其形态发生主要有两种解释：裂生过程（schizogenous）和溶生过程（lysigenous），后者涉及程序性细胞死亡。已有六个独立的遗传位点（gl1, gl2, gl3, gl4, gl5, gl6）被报道与色素腺形成相关，其中gl2和gl3是主要的遗传因子。通过精细的遗传图谱分析，识别了主导无色素腺表型的基因GoPGF（Gossypium Pigment Gland Formation），其低表达导致棉花无色素腺表型。
本文还通过比较转录组分析识别了与色素腺形成相关的基因，并发现MYB转录因子CGP1在色素腺着色中起调控作用。尽管已有多种与色素腺形成相关的基因被识别，但其发育过程和调控网络仍不清楚。
单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术为研究植物的转录组提供了新视角，已被用于解析根部、茎尖分生组织及特定细胞谱系的转录组特征。本文利用scRNA-seq分析浸泡48小时后发芽的G. bickii种子的子叶，结合整体和单细胞测序分析及病毒诱导基因沉默（VIGS）验证，深入理解了棉花色素腺形态发生的生物过程及其调控机制，为研究延迟色素腺形态发生特征提供了理想材料。
主要结果
构建棉花子叶的单细胞转录组图谱
本文研究了G. bickii的休眠棉籽，发现其在种子浸泡后约36小时，子叶中开始出现稀疏的色素腺（pigment glands），并在种子发芽12小时后检测到逐渐积累的棉子酚（gossypol）。这种色素腺的逐步形成被称为“延迟色素腺形态发生”（delayed pigment gland morphogenesis）。为探讨色素腺形态发生的分子机制，本文采用单细胞RNA测序（scRNA-seq），在浸泡48小时后采集种子子叶，观察到色素腺在不同发育阶段的活跃形态。
通过10X Genomics平台获得了13,495个细胞的转录组数据，经过质量控制后保留了12,222个单细胞，发现14个不同的细胞簇。使用主成分分析（PCA）和UMAP算法可视化这些细胞簇，并通过已知的标记基因识别每个簇的细胞类型。最终，14个细胞簇被分为八个细胞群体，包括叶肉细胞（mesophyll cell）、色素腺细胞、表皮细胞（epidermal cell）、保卫细胞（guard cell）、木质部细胞（xylem cell）、前韧皮部细胞（procambium cell）、韧皮部薄壁细胞（phloem parenchyma cell）和伴胞（companion cell）。
在色素腺细胞群体中，使用与棉子酚生物合成相关的标记基因（如CDNC、CYP706B1和DH1）进行识别，结果显示其在UMAP图中明显与其他簇分离。通过原位杂交进一步验证了色素腺细胞的身份。此外，细胞群体主要位于UMAP图的左侧，特定标记基因的表达帮助确认了不同类型的细胞。
为了验证新的细胞标记基因，本文对每个细胞群体中上调显著的前10个基因进行了表达谱分析，并通过原位杂交验证了新的细胞标记基因GbiCYTB5-E和Gbitmem97的可靠性。这些新的标记基因将为植物，特别是棉花的单细胞RNA测序研究提供有用工具。
最后，进行了基因本体（GO）和京都基因组百科全书（KEGG）通路分析，结果显示大多数富集的术语或通路与特定细胞类型相关，进一步支持了细胞类型基因的识别方法。
色素腺细胞的发育轨迹
色素腺形态发生转录因子调控网络的构建
本文探讨了转录因子（TFs）在棉花（Gossypium）色素腺发育中的关键作用。研究发现，色素腺细胞中的TFs主要与薄壁细胞的分化相关，包括bHLH（基本螺旋-环-螺旋）、AP2/ERF（APETALA2/乙烯响应因子）、C2H2（C2H2锌指）、GRAS（GAI-RGA和SCR）、NAC（NAM、ATAF1、2和CUC2）和WRKY（Janga et al., 2019）。AP2/ERF和WRKY调控从薄壁细胞到分泌细胞的转变，而MYB则调控从分泌细胞到前凋亡细胞的转变（补充图8和图3D）。
通过对GoPGF（一个bHLH转录因子）的DNA亲和纯化测序（DAP-seq）分析，识别出其下游基因，并建立了以GoPGF为中心的转录因子网络，包括AP2/ERF、bHLH、C2H2、MYB、NAC和WRKY（图3B和图3C）（Gao et al., 2020）。本文提出了棉花色素腺发育的工作模型，表明成熟的色素腺由多层成熟薄壁细胞、外层的单层分泌细胞和内部的凋亡细胞残留物组成（图3D）。
为验证该模型，分析了G. bickii子叶的RNA-seq数据，发现大多数TFs在发芽过程中表达上升（图4A）。通过VIGS（病毒诱导基因沉默）实验验证了八个TF的功能，其中沉默GbiGoPGF（bHLH）导致完全无腺表型（图4B）。沉默所有八个TF（包括新基因GbiERF114（AP2/ERF）、GbiZAT11（C2H2）、GbiNTL9（NAC）及已知同源基因）显著影响色素腺发育，沉默幼苗的色素腺密度和戊烯醇含量显著低于阴性对照组（图4C和图4D）。结果表明，这些TF在棉花色素腺形成中可能发挥重要作用。
光与赤霉素在色素腺形成中的作用
本文通过对G. bickii子叶（种子浸泡后0、12、24、36和48小时）的批量样本进行分析，选择了45个Scissor+细胞和57个Scissor细胞，这些细胞与色素腺密度表型相关（补充图1C和图10A）。为揭示影响色素腺形成的因素，进行了功能富集分析，结果发现Scissor+细胞中激活了与光合作用相关的通路（补充图10B）。此外，通过PlantCARE预测了色素腺发育TFs启动子序列（2000 bp）中的顺式调控元件，发现多个与光和赤霉素响应相关的元素（图5A）。
为研究光和赤霉素在色素腺形成中的作用，观察了在不同处理条件下
（黑暗、光照、赤霉酸（GA3）和氟氯噻吨（赤霉素合成抑制剂））
G. bickii种子子叶上色素腺的发育。
在黑暗、黑暗+氟氯噻吨和光+氟氯噻吨条件下，直到种子浸泡后60小时均未观察到色素腺。黑暗+氟氯噻吨条件下的色素腺密度显著低于黑暗和光+氟氯噻吨条件（图5C）。
相反，在黑暗+GA3、光照和光+GA3条件下，种子浸泡后36小时观察到了色素腺（图5B），其中光+GA3条件下的色素腺密度显著高于光照条件和黑暗+GA3条件（图5C）。这些结果表明，光和GA3能够促进色素腺的形成。
此外，GA3的积极作用与近期研究结果一致，表明GA信号通过GoSPGF增强GoPGF的表达（Zang et al., 2021）。为了解光照变化下的转录模式，比较了G. bickii子叶在黑暗和光照处理24小时后的色素腺发育TFs的表达水平。结果显示，GbiCGF1（bHLH）、GbiGoPGF（bHLH）、GbiZAT11（C2H2）、GbiGoSPGF（GRAS）和GbiCGP1（MYB）在无光条件下表达下调，而GbiERF114（AP2/ERF）、GbiNTL9（NAC）和GbiCGF2（NAC）的表达则上调（图5D和补充表11）。此外，大多数戊烯醇合成基因在黑暗条件下表达上调，提示光可能抑制戊烯醇合成（图5E和补充表11）。
总结与讨论
本文探讨了棉花（Gossypium）色素腺的形成与发育，强调了其在植物防御中的重要性。色素腺被视为具有生物活性和特化代谢物的防御结构。通过单细胞RNA测序（scRNA-seq），本文清晰区分了色素腺细胞与其他细胞类型，为理解色素腺发育提供了微观视角。
研究支持了色素腺发育的溶酶体过程假说，表明年轻的色素腺薄壁细胞在转录因子的调控下分化为分泌细胞和成熟薄壁细胞。分泌细胞的自溶作用释放戊烯醇等分泌产物。通过整合转录组数据，识别了关键基因，包括GoPGF、CGF基因和GoSPGF，这些基因在色素腺发育中发挥重要作用（Ma et al., 2016; Janga et al., 2019; Cai et al., 2020; Gao et al., 2020; Zang et al., 2021）。GoPGF被确定为主要调控因子，并与AP2/ERF、bHLH等转录因子协同作用。
研究还表明，光照和赤霉素（GA）对色素腺发育有促进作用，并可能存在光与GA之间的交叉调控（图5B）。此外，色素腺密度与戊烯醇含量高度相关，但色素腺的形成与戊烯醇的生物合成由不同的分子机制调控。黑暗和光照处理的比较转录组分析显示，光照促进色素腺发育但抑制戊烯醇生物合成。
最后，本文指出scRNA-seq技术为研究棉花色素腺的形态发生提供了新见解，并强调了未来通过转基因技术改善棉花色素腺特性的重要性。尽管scRNA-seq技术在植物研究中不断进步，但仍面临挑战。未来结合空间转录组学、染色质可及性、DNA甲基化和蛋白质组学的多重单细胞分析将有助于更全面地理解植物细胞特性，特别是棉花纤维的发育（Pang et al., 2009; Haigler et al., 2012; Huang et al., 2021; Pei et al., 2022）。
小tip：
人类/非人类灵长类动物/家畜/ 除了小鼠、大鼠、鱼、昆虫、苍蝇外默认的其他物种
完整的基因名称不用斜体和希腊字母
例如：insulin-like growth factor 1(胰岛素样生长因子1)
基因符号不使用希腊字母和连字符，基因符号用斜体，所有的字母用大写
例如：IGF1
蛋白质的名称与基因符号相同，但不用斜体，并全部大写
例如：IGF1
mRNA和cDNA的基因符号和规定的格式
例如："... levels of IGF1 (italicized) mRNA increased when..."
文献来源
Sun, Y.; Han, Y.; Sheng, K.; Yang, P.; Cao, Y.; Li, H.; Zhu, Q.-H.; Chen, J.; Zhu, S.; Zhao, T. Single-Cell Transcriptomic Analysis Reveals the Developmental Trajectory and Transcriptional Regulatory Networks of Pigment Glands in Gossypium Bickii. Molecular Plant2023, 16, 694–708, doi:10.1016/j.molp.2023.02.005.
