今天来看一篇转录因子的文章。这次我们不解析结果（反正都很厉害），来看看他的材料与方法。从而学习一些分析流程。
总体而言，转录组只是其中很小的一步。全文围绕着验证展开。很套路的一篇文章，但是套路到极致就是模板，好像我印象中的每一个实验这篇文章都做了，堪称完美！
摘要
本研究识别了葡萄（Vitis vinifera）中一种冷诱导的基本螺旋-环-螺旋（bHLH）转录因子VvbHLH036。对VvbHLH036的过表达和CRISPR/Cas9介导的敲除（KO）分别增强和降低了葡萄根系的耐寒性。转录组分析显示，VvbHLH036过表达的根系中，苏氨酸合成酶（VvThrC1）被确定为其潜在下游靶标。研究确认VvbHLH036能够结合VvThrC1启动子并激活其表达。在冷处理下，葡萄叶片和根系中VvThrC1转录本及苏氨酸含量显著增加，而在CRISPR/Cas9介导的VvbHLH036 KO根系中则显著抑制。此外，VvThrC1的过表达和KO也证实了其在调节苏氨酸含量和低温耐寒性中的作用。外源苏氨酸处理提高了葡萄叶片的耐寒性，并减少了超氧阴离子和过氧化氢的积累。这些发现表明VvbHLH036和VvThrC1在葡萄冷胁迫反应中通过调节苏氨酸生物合成发挥关键作用。
这张图就是这篇文章的灵魂
材料与方法
植物材料和冷处理
组培的葡萄（V. vinifera cv. “Muscat hamburg”和 V. amurensis）幼苗在锥形瓶中生长于半浓度的 Murashige 和 Skoog 培养基（pH 5.8），并置于生长箱中（26 °C；06:00 AM 起 16 小时光照/22:00 h 起 8 小时黑暗；相对湿度 50%）。根系和从芽尖开始计算的第三片叶子在 4 °C 处理后（从 10:00 AM 开始）于 0、2、4、8、24 和 48 小时收集，用于基因表达的检测。
简单介绍了试验所用的材料和处理，并且该有的数据都有，从10:00AM开始取是一个点睛之笔，因为转录组的数据和植物的状态相关。假如培养箱的光照参数能一并给出那就最好了，不过可能光照培养箱是那种接日光灯的，调节光强只能通过开关部分的灯来实现所以就不知道光照强度了。现在高级的光照培养箱是用LED灯了，可以控制光照强度和光质。
VvbHLH036 的分离与序列分析
基因特异性引物 bHLH036-F 和 bHLH036-R 被设计用于扩增完整的 VvbHLH036 cDNA 序列（补充表 S5）。通过使用 DNAMAN 6进行比对，比较了 VvbHLH036 与其他物种中 bHLH036 同源物的氨基酸序列。通过邻接法在 MEGA5 上构建了一个系统发育树，并进行了 1,000 次自助抽样重复。
这边涉及到一个知识点，近源物种建树用DNA序列，远源物种建树使用氨基酸序列。这样做的原因是，密码子存在简并性，DNA序列的差异比氨基酸序列大，一般远源物种的DNA差异过大，用氨基酸序列可以中和一下。另外，我不知道这边为什么使用NJ法，这个建树方式我个人感觉十分粗糙，只有在样本量大的离谱的情况下才会去使用（文章中就6条），一般来说我会使用ML和BI法。但是NJ法我在很多高级期刊里面还是能看到（搭配着MEGA）。
定量逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）
RNA 提取和 RT-qPCR 按照 Hou 等人 (2023) 的描述进行。简而言之，按照制造商的说明，从每个样本提取 0.1 克的总 RNA，使用多糖酚类植物总 RNA 提取试剂盒 (TIANGEN, 北京, 中国)。以 1 μg RNA 作为模板，使用 Transcript One-step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix (Transgen, 北京, 中国) 合成 cDNA。根据 SYBR qPCR Master Mix (Vazyme, 南京, 中国) 的协议，在 StepOne Plus 荧光定量 PCR 系统 (Life Technologies, 美国) 上进行定量 PCR。ACTIN (VIT_204s0044g00580 (Vitvi04g01613)) 和 MDH (VIT_207s0005g03350 (Vitvi07g00599)) 被用作参考转录本。双内参数据分析的标准化按照 Hellemans 等人 (2007) 的协议进行。每个样本进行了三次生物重复实验。使用 TBtools 计算相对表达。所有引物列在补充表 S5 中。
qPCR基本上都要做的，现在都要求干湿结合才能发表了。即生信分析（转录组）表明xx基因发生了上调或下调，qPCR跑一下真实环境，看该基因是不是真的发生了改变。另外，现在都用试剂盒了，实验流程一般不会有问题，qPCR关键还是内参基因基因要选择好。
转录激活测定
VvbHLH036 的编码序列 (CDS) 被克隆并通过同源重组技术插入到 pGBKT7 向量中。所有引物列在附加文件 1 中。根据 Matchmaker 酵母转化系统 2（Clontech，美国）的说明，将 pGBKT7-VvbHLH036、pGBKT7（阴性对照）和 pGBKT7-p53（阳性对照）的质粒转移到酵母菌株 AH109 中。每个转化的单克隆菌株在筛选培养基中被稀释并滴在 SD/-Trp 培养基和 SD/-Trp/-His 培养基上。在 30 ℃ 条件下培养 3 天后观察培养皿。所有引物列在补充数据 S5 中。
传说中的酵母双杂实验，验证转录因子的有效性，也就是最后能不能转录出报告基因（在缺素培养基上决定了能否存活）。转录因子有DNA结合域（BD）和转录激活域（AD），VvbHLH036是结合激活域的，pGBKT7-p53是一定能转出来，pGBKT7是一定不能转出来，所以看pGBKT7-VvbHLH036的结果是和谁一样。
亚细胞定位
VvbHLH036 或 VvThrC1 的 CDS（无终止密码子）通过同源重组技术克隆入 pSAK277-eGFP 载体。然后，将包括 pSAK277-eGFP、pSAK277-GFP-VvbHLH036、pSAK277-GFP-VvThrC1 和 VirD2NLS-mCherry（含 mCherry 并用作细胞核标记）的质粒分别转化入农杆菌 GV3101 株中。挑取每个转化的单一阳性克隆，培养于液体 LB 培养基中。对于瞬时转化，N. benthamiana 叶片按照之前描述的方法（Geng 和 Liu 2018）用 GV3101 浸润。为了观察 VvbHLH036 的亚细胞定位，将含有 pSAK277-GFP-VvbHLH036 和 VirD2NLS-mCherry 的混合农杆菌悬液共同注射到 N. benthamiana 叶片中。而没有 VvbHLH036 的 pSAK277-eGFP 质粒则与 VirD2NLS-mCherry 共同转化入对照叶片中。为了观察 VvThrC1 的亚细胞定位，分别将 pSAK277-eGFP 和 pSAK277-GFP-VvThrC1 转化入 N. benthamiana 叶片中。三天后，将剥离的 N. benthamiana 叶片浸泡在酶解溶液中（0.6%（重量/体积）纤维素 R10，0。5%（重量/体积）maceroyzme R10%和 9%（重量/体积）甘露醇在 25℃的黑暗环境中培养 4 小时。每个转化观察到三个以上的原生质体，图像通过共聚焦激光扫描显微镜（Leica TCSSP8，德国）拍摄。GFP 荧光信号和叶绿体自发荧光分别在 488 nm 激发后于 500 至 535 nm 和 650 至 750 nm 处被检测，而 mCherry 在 543 nm 激发，并在 580 至 630 nm 处扫描。所有引物列在补充表 S5 中。
我对亚细胞定位的理解还不够，只知道这项技术是用来确定蛋白质的位置，以辅助研究其生物学功能的。看起来挺复杂的。
N. benthamiana是本生烟，对大部分病毒易感
葡萄藤毛状根转基因系统
V. vinifera cv. “Muscat Humburg” 历来被视为阐明寒冷响应机制和途径的模型，在过去十年中得到了广泛研究（Wang et al. 2014；Li et al. 2014a；Li et al. 2014b）。本研究中，从 V. vinifera 的 cDNA 中扩增了 VvbHLH036 和 VvThrC1 的 CDS，并克隆到过表达载体 pSAK277-3×HA-3×Flag 中，该载体具有 35S 启动子驱动的表达。VvbHLH036 和 VvThrC1 通过 CRISPR/Cas9 编辑生成失活突变体，如之前所述（Liu et al. 2022）。使用 CRISPR-P 工具（http://crispr.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR2/SCORE）选择针对 VvbHLH036（靶位点 1: CATTCTTCTTCGGTTTCCA；靶位点 2: GGAAACCTGGAGAAACTCA）和 VvThrC1（靶位点 1: GTCACGCTCCGGCGGGCTTC；靶位点 2: TCCTCACACCGGCGTGGCGC） 的特异性 sgRNA，并将 sgRNA 克隆入 CRISPR/Cas9 载体 pKSE401，以生成编辑载体（Tang et al. 2018）。所有引物列于补充数据 S5 中。
根据先前的报告（Meng et al. 2019），建立了一种由 A. rhizogenes 诱导的葡萄藤毛根转基因系统。具体而言，将 35S 启动子驱动的过表达载体 pSAK277-VvbHLH036/VvThrC1 和 CRISPR/Cas9 载体 pKSE401-VvbHLH036/VvThrC1 转化到 A. rhizogenes MSU440 中，经过三天培养后在抗生素培养基上筛选出单一阳性克隆。单克隆菌株在 OD = 0.8 时挑取并过夜培养，然后在 28 °C 下加入乙酰香草醇（100 μM）激活 2 小时后静置。将 6 周龄的 V. vinifera cv. "Muscat hamburg"幼苗的茎段剪成包含两个芽的段，浸入悬液中 8 分钟。将茎段转移到 1/2 MS 培养基中，在 25 ℃黑暗环境下共培养 2 天。然后，用无菌水（400 mg/L 头孢噻肟钠（cef） + 400 mg/L 卡宾青霉钠（carb））清洗茎段 5 分钟，重复三次。将植物愈伤组织转移到新的 1/2 MS 培养基（200 mg/L cef + 200 mg/L carb + 10 mg/L kan）中，在 26 ℃下培养 1 个月。阳性根生长后的后续实验被进行。
转基因体系需要组培体系，组培体系，组培体系，需要农杆菌侵染成功，农杆菌侵染成功，农杆菌侵染成功！
A. rhizogenes 是发根农杆菌
相对电导率检测
相对电导率（EL）率用于评估过表达或缺失基因（KO）根系的耐寒性，遵循 Warren 等人（1996）描述的协议。含有目标载体和空载体（EV）的转基因根系被放置在一个含湿滤纸的 10 毫升离心管中。在黑暗条件下，在恒温培养箱中以−5 °C 处理 4 小时，然后在 4 °C 下过夜后切割至 0.5 毫米的长度。加入 3 毫升去离子水，在 28 °C 下以 150 转每分钟摇动 1 小时后，使用电导率计（梅特勒·托利多，上海，中国）测定电解质电导率，并标记为初始电导率（C1）。样品在 100 °C 水浴中处理 20 分钟，然后冷却至室温，且体积加至 3 毫升。随后，测量最终电导率（C2），并使用公式计算相对 EL 率：(C1/C2) × 100%。
电导率检测是抗性基因检测的一个生理生化指标，相似的还有丙二醛(MDA)，SOD(超氧化物歧化酶)和POD等。后面这些指标他也测了。我个人感觉相对电导率这个指标不太好，因为特异性不太够，而且实验中的影响因素挺多的。
RNA 测序及相关数据分析
转基因根系过表达 VvbHLH36 或为 EV 的样本被收集并立即用液氮冷冻，储存于-80°C。总 RNA 的提取如前所述进行。文库构建按照 KC-Digital Stranded mRNA Library Prep Kit（Seqhealth 科技有限公司，武汉，中国）进行，测序按照 Hou 等人（2023 年）所描述的方法进行。RNA-seq 也按照 Hou 等人（2023 年）的方法进行。简而言之，使用 fastp v0.20.0（Chen 等，2018 年）执行原始双端读数的预处理（例如，接头去除、滑动窗口修剪、长度和质量过滤），如下所述。接下来，读取映射针对 12X.v2 葡萄 PN40024 参考基因组（https://phytozome-next.jgi.doe.gov/）的组装，使用 hisat2 以默认设置和-sensitive 选项（Kim 等，2015 年）实现。随后使用 FeatureCounts（Liao 等，2014 年）和 CRIBI V2 预测（Vitulo 等，2014 年）进行基因计数汇总，如前所述。使用 edgeR（Robinson 等，2010 年）在 R 中利用准似然 F 检验方法（https://cran.r-project）。在 org/）中，log2 倍数变化（>1 或<−1）且假发现率（FDR）<5%表明处理组之间存在差异表达基因（DEGs）。所有相关的数据集，如表达和 DE 基因表（也包含相应的 V3 注释，参见 Canaguier 等，2017）均包含在补充数据 S1 中。
MapMan BIN 类别的功能富集（Schwacke 等，2019）是通过费舍尔确切检验结合假设多重检验校正（使用 FDR），如之前所述（Wong，2020；Wang 等，2021a，2021b）进行识别的。计算出的 FDR < 0.05 的 BIN 类别被视为显著富集。对优先选择的差异表达基因进行靶向顺式调控元件（即 CACGTG 或 G-box）富集分析，方法如之前所述（Wong，2020；Wang 等，2021a，2021b）。简而言之，使用 PatMatch（Yan 等，2005）在差异表达基因的启动子（转录起始位点 TSS 上游 1 kb，包括正负链）中筛选 G-box 顺式调控元件的精确模式匹配。记录并可视化 G-box 相对于 TSS 的位置及其频率，以便对 TSS 的聚类（即位置偏差）以及在 R 中基于超几何分布的富集进行分析，如之前所述。使用 R 中的内置 hclust 和 gplot 函数分别实现层次聚类和热图可视化。
总结一下就是，RNA数据的质检和质控——hisat2比对——FeatureCounts定量——edgeR做DEGs分析——差异基因功能富集
氨基酸含量的测定
氨基酸的提取方法按照 Jiang 等人（2022）的描述进行。约 0.2 克样品立即收集并在液氮中冷冻。使用高通量冷冻组织研磨机（Scientz-48 L，宁波，中国）将样品研磨成粉末，并悬浮在 4 毫升去离子水中。经过 30 分钟的超声提取后，样品在 12000×g 下离心 30 分钟。上层液体通过 0.22 微米过滤器过滤，25 微升上层液体被注入氨基酸分析仪 ICS 5000+（赛默飞世尔科技，美国）上，使用 Dionex AminoPacTM PA-10 BioLCTM（赛默飞世尔科技，美国），流动相为无菌水和 25 毫摩尔钠 hydroxide 溶液（赛默飞世尔科技，美国）。标准氨基酸（谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、精氨酸、苏氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和赖氨酸）的峰值作为定性基础和标准曲线计算的依据。每个样品中 13 种氨基酸的含量通过其面积与各种氨基酸标准曲线的外推进行了确定。
这个指标物美价廉，我印象中这东西和ICP一样，测一次就能出所有的结果，然后一个样本的价格也还好。我觉得一开始作者也不知道冷胁迫会对氨基酸通路产生影响，是RNA-seq做了之后才知道的，然后补充的指标。这个很正常。不过做之前其实该转录因子会对哪些通路产生影响，大致也会有概念。
酵母单杂交（Y1H）检测
Y1H 实验按照 Yang 等人（2023）的方法进行。来自 VvThrC1 启动子（−342 bp 到−167 bp）的片段（-CACGTG-）和突变片段（-CAAAAG-）被插入到 phis2 载体中。VvbHLH036 的编码区（CDS）被克隆入 pGADT7 载体中。不同的 phis2 质粒与 pGADT7 载体组合，并根据 Matchmaker 酵母转化系统 2（Clontech, USA）的说明共同转染到酵母菌株 Y187 中，并涂布在筛选培养基上。单个阳性克隆被稀释并滴在 SD/-Trp/-Leu 和 SD/-Trp/-Leu/-His + 100 mM 3-氨基-1,2,4-噁唑（3AT）培养皿上。这些培养皿在 30℃下培养 3 天后观察。
酵母单杂（Y1H）和酵母双杂（Y2H）的区别
Y1H：
（1）目标DNA序列（如启动子）被克隆到酵母表达载体中，通常与报告基因（如酵母的His基因）结合。
（2）转录因子的编码序列被克隆到另一个载体中。
（3）通过转化酵母，观察转录因子是否能够结合到目标DNA上，从而激活报告基因的表达。
Y2H：
（1）两种蛋白质分别与转录激活域（AD）和DNA结合域（BD）融合。
（2）如果这两种蛋白质相互作用，它们会结合在一起，形成一个完整的转录因子，从而激活下游报告基因的表达。
（3）通过转化酵母，观察报告基因的表达情况来判断蛋白质之间的相互作用。
Y1H：通过观察酵母在选择性培养基上的生长情况，判断转录因子是否与目标DNA结合。
Y2H：通过观察酵母在选择性培养基上的生长情况，判断两种蛋白质是否相互作用。
双重 LUC 检测
VvbHLH036 的 CDS（不含终止密码子）被克隆到 pGreenII 62-SK 载体中作为效应子。包含-CACGTG-元件或突变元件（-CAAAAG-）的 VvThrC1 的 1800bp 启动子被引入到 pGreenII 0800-LUC 载体中作为报告基因。所有效应子和报告基因分别转化到携带 pSOUP 质粒的农杆菌株 GV3101 中。选择单克隆菌株，并在过夜培养至 OD = 0.8，然后在 28 °C 下加入乙酰香草醛激活 2 小时，随后注入弯曲叶昼夜草(N. benthamiana)叶片（Wang 等，2019）。在 26 °C 下培养 3 天后，按照双荧光素酶报告系统（Promega, 北京, 中国）的说明测量 LUC 和 REN 的酶活性。为了观察 LUC 荧光，使用 1 mM D-荧光素溶液喷洒在渗透的叶片上，然后将这些叶片置于黑暗中 5 分钟。应用化学发光成像系统（Clinx, 上海, 中国）拍摄荧光图像。
双重LUC检测通常使用两种不同的荧光素酶（如萤火虫荧光素酶和海洋荧光素酶）作为报告基因，能够同时监测两个不同的转录事件。这使得研究人员可以评估特定启动子或调控元件的转录活性。
常用的报告基因有：氯霉素乙酰转移酶 （CAT），β半乳糖苷酶（β-gal或LacZ），萤光素酶（Luciferase）以及EGFP等荧光蛋白。其中萤光素酶报告基因具有检测便捷、灵敏度高、线性范围宽、可以进行活细胞和活体检测等优点，使用非常广泛。
电泳迁移率变化分析
EMSA 的实验按照 Xie 等人（2018）的研究进行。简而言之，将 VvbHLH036 的编码区克隆到 pET28a 载体中，生成 His 标签融合蛋白，并在大肠杆菌 BL21（DE3）菌株中表达。重组的 VvbHLH036 His 标签蛋白通过 Ni 亲和色谱法诱导和纯化。含有 G-box 元素（-CACGTG-）或突变元素（-CAAAAG-）的 5′端生物素标记探针与融合蛋白共同孵育，EMSA 实验根据化学发光 EMSA 试剂盒（Beyotime, 上海，中国）的协议进行。所有探针详见补充数据 S5。
冷耐性评估通过半致死温度测定
半致死温度的测定按照 Sun 等人（2016 年）的描述进行。在本研究中，测量半致死温度以研究外源 L-苏氨酸处理对葡萄冷耐性的影响。简而言之，在 L-苏氨酸（100 mg/L）处理 2 小时后，从 V. vinifera 幼苗中收集叶片圆片。将五个叶片圆片装入 10 mL 离心管，放入光照培养箱中在 0 ℃下孵育 1 小时，然后每小时降温 2 ℃。在−4、−6、−8、−10 和−12 ℃时取出离心管，并放置在 4 ℃下过夜。相对电导率（EL）速率按照上述方法测量。每个时间点测量五个生物重复，半致死温度（LT50）通过逻辑斯蒂方程计算。
生理分析
NBT（硝基蓝四唑）和 DAB（二氨基联苯胺）染色实验按照以前的描述进行（胡等，2021）。对 6 周大的葡萄苗喷洒外源性苏氨酸（100 mg/L）或无菌水。在室温下孵育 2 小时后，幼苗在 4°C（冷胁迫）或 26°C（对照）条件下处理 4 小时。H2O2 和 O2−的含量分别使用过氧化氢检测试剂盒（建程，南京，中国）和超氧阴离子活性检测试剂盒（Solarbio，北京，中国）进行测定。SOD、POD 和 CAT 活性分别使用超氧化物歧化酶检测试剂盒（建程，南京，中国）、过氧化物酶检测试剂盒（建程，南京，中国）和催化酶检测试剂盒（可见光）（建程，南京，中国）进行测定。每个实验均进行三次生物重复。H2O2 和 O2−也分别用 DAB 和 NBT 染色。简而言之，从 CK 和外源性苏氨酸处理的葡萄中采集的叶片在低温暴露前后，浸泡在反应缓冲液中，在 37°C 黑暗中进行染色。然后，染色液被倾倒，样品在观察之前用无水乙醇脱色。
统计分析
所有实验均进行了至少三次独立的生物重复，相关数据或数值以均值 ± 标准差表示。统计比较使用 SPSS 进行，显著性通过双尾 Student's t 检验或 Duncan 事后 ANOVA 进行评估。P 值 < 0.05 被认为具有统计学意义。
主要结果
我不对结果做解释，这边我主要介绍一下他的分析思路。
VvbHLH036 的鉴定和注释
VvbHLH036 的分子特征解析
VvbHLH036 正向调节葡萄藤的耐寒性
在 VvbHLH36 过表达的葡萄中冷应答基因表达的调节
在过表达 VvbHLH36 的葡萄中，特定氨基酸代谢通路的重编程
冷胁迫诱导的葡萄根部氨基酸重编程
一个苏氨酸合酶（VvThrC1）是 VvbHLH36 的一个候选下游靶基因
VvbHLH036 通过直接结合 VvThrC1 启动子激活 VvThrC1 的转录
VvbHLH036 功能的缺失抑制了低温下苏氨酸的积累
过表达 VvThrC1 增强了转基因葡萄根部的耐寒性
外源苏氨酸提高了葡萄藤叶片的耐寒性，并降低了 O2−和 H2O2 的含量
作者先是对要研究的bHLH036转录因子作介绍，知道她的结构（1）（2），和她在近缘物种中的样子（主要是指出保守域）。一开始总要介绍一下你的研究对象吧。
然后是证明VvbHLH036能正向调控葡萄藤的耐寒性（3），其在（2）中通过qPCR测出冷处理下，VvbHLH036会随着处理时间增加而增加再降低（很标准的一个响应曲线）。但这不能证明VvbHLH036能增强植物的耐寒性，只能说VvbHLH036对冷胁迫有响应。举个例子，逆境胁迫下MDA也会增加，但我不能说MDA帮助抵抗胁迫，MDA在这边是作为评定受伤害程度的一个指标。这边就是开始说明（证明）研究对象的作用。所以才会需要（3）做转基因，然后测定耐寒性指标（EL等）去评价VvbHLH036的贡献。
现在知道了VvbHLH036能增强抗寒性，但具体是通过哪个途径实现的还不清楚，所以在（4）中进行了转录组分析，后面又进行了功能富集。另外，这边用的是过表达的植株和普通植株比，当然也可以用普通植株和突变型（假如有）比。这一步我称他为明确作用的对象。在（5）中，具体分析了和氨基酸代谢相关的基因。此时就引出了本文的中心——某氨基酸通路。
我对（6），说实在的，我没看到，为什么要限定在根中，是不是叶子，茎干也可以。
在（7）中筛选出一个目标靶基因，也就是冷胁迫可以影响具体的苏氨酸合成途径，后面的（8）（9）（10）都是围绕着这个途径进行的验证性实验。（8）通过酵母双杂实验，证明VvbHLH036可以激活Thrc1的转录，（9）从反向证明没有VvbHLH036，冷胁迫就不能激活其转录，这样就证明了有且只有VvbHLH036可以激活其转录。（10）和（3）的区别就是，试验进行到（10）的时候，已经明确了氨基酸合成途径，此时可以进行亚细胞定位去确定作用的区域。
（11）这一步我也不理解，为什么施用外源性的物质也可以，植物表皮吸收完物质是直接用的？但我明白这步的作用是证明起作用的物质的确是苏氨酸。
文献来源：
Hou Y, Wong DCJ, Sun X, Li Q, Zhou H, Meng L, et al. VvbHLH036, a basic helix-loop-helix transcription factor regulates the cold tolerance of grapevine. Plant Physiology. 2024;:kiae483.
