水在竹子的快速生长和渗透胁迫中发挥着至关重要的作用。然而，水分运输的分子机制仍不清楚。在本研究中，通过对毛竹（Phyllostachys edulis）根压和转录组数据的联合分析，发现了一个水通道蛋白基因PeTIP4-3。PeTIP4-3在茎中的表达水平很高，特别是在维4管束鞘细胞中。PeTIP4-3的过表达可以提高转基因酵母和水稻的耐旱和耐盐能力。通过加权基因共表达网络分析（WGCNA），揭示了PeSAPK4、PeMYB99和PeTIP4-3的共表达模式。PeMYB99表现出能够独立结合并激活PeTIP4-3的能力，从而增强对干旱和盐胁迫的耐受性。PeSAPK4能够在体内和体外与PeMYB99相互作用并对其进行磷酸化，二者协同加快PeTIP4-3的转录。PeMYB99和PeSAPK4的过表达也使转基因水稻获得耐旱和耐盐能力。此外，进一步的ABA处理分析表明，PeSAPK4通过ABA信号增强了在应激条件下的水分运输。综合而言，提出了一个由ABA介导的PeSAPK4-PeMYB99-PeTIP4-3级联调控机制，该机制主导毛竹中的水分运输。水是维持生命的基本要素，尤其对植物的生长和发育至关重要。水分胁迫会显著抑制植物生长，导致生长迟缓、授粉失败和根部发育异常。在小麦中，水分的可用性直接影响生物量积累和幼穗分化；在水稻中，干旱条件会导致开花延迟、小穗减少和灌浆不良。因此，提高植物的水分吸收能力是增强其抗旱性的有效策略。水通道蛋白（AQPs）是细胞膜上主要的水运输通道，其中一类称为液泡膜内在蛋白（TIPs），具有显著的水运输能力。TIPs的表达水平会因非生物胁迫而动态变化，表明它们在调节水分平衡以响应环境压力中起着关键作用。MYB转录因子是植物中最大的TF家族之一，已知在调节水分平衡中发挥关键作用，通过结合目标基因的启动子区域来激活或抑制基因表达。SnRK2激酶家族是植物特有的小家族，对冷、干旱和盐胁迫的响应至关重要，通过磷酸化多种底物，包括转录因子，来调节植物的逆境反应。本研究聚焦于毛竹，这是一种重要的非木材森林树种，其快速生长的竹笋在生长过程中依赖于成熟竹子通过根-根茎系统提供的营养和水分。尽管已有一些关于毛竹中与水分运输相关的基因的研究，但其转录调控机制尚不明确。本研究旨在鉴定与毛竹水分运输相关的关键基因，并探索其分子和生理机制。通过分析竹笋根压的昼夜变化和转录组数据，预测了与水分运输相关的基因，并克隆了毛竹中的一个TIP基因PeTIP4-3，在酵母和水稻中验证其功能。研究发现，PeMYB99可以直接调控PeTIP4-3的表达，而PeSAPK4可以与PeMYB99相互作用并磷酸化它，二者协同促进PeTIP4-3的转录。此外，PeSAPK4响应干旱和盐胁迫，通过ABA介导的信号通路促进PeTIP4-3的转录。综上所述，本研究提出了一条ABA介导的PeSAPK4-PeMYB99-PeTIP4-3级联，调控毛竹的水分运输。本研究对三种毛竹笋的根压进行了24小时昼夜周期的测量。结果显示，毛竹根压呈现出昼夜节律，白天为负压，夜间为正压（图1a），与吐水节律相似（郑等，2021）。特别地，在18:00至21:00期间，根压急剧上升，这一时段与竹笋最快生长速率相吻合（程等，2017）。为了探究竹笋昼夜动态变化的遗传基础，本研究采集了八个不同时间点的样本，共24个样本，进行RNA-Seq分析，获得了210.69Gb的清洁数据，并鉴定出41396个表达基因。通过加权基因共表达网络分析（WGCNA），将5460个基因归类为18个模块，基于其表达模式（图1b）。这些模块代表了高互联性和潜在功能关系的基因簇。特别是，Greenyellow、Black、Darkgreen、Blue、Cyan、Purple、Gary60和Darkred模块与样本（G1–G8）分别显示出强烈的关联（R ≥ 0.85, P ≤ 0.01）（图1c）。根据24小时内的根压变化，本研究假设Cyan模块中的基因与竹笋的水分运输相关（图1a,d）。随后，本研究在Cyan模块中预测了重要的转录因子和蛋白激酶，包括HD-ZIP、MYB、NAC、CAMK和RLK（表S4）。在该模块中鉴定出两个PeAQP基因（PeTIP4-2和PeTIP4-3），其同源基因已被报道参与水分运输。特别地，PeTIP4-3在G5样本中表达量极高（FPKM>1200），是G1样本的30倍（图1e）。先前的研究强调了AQPs在高效水分运输和应激响应中的作用。因此，本研究提出PeTIP4-3可能在竹子的水分运输中发挥重要作用。为了确定PeTIP4-3的特异性表达，本研究对其在六种不同组织中的表达进行了定量聚合酶链反应（qPCR）分析，结果显示PeTIP4-3在竹笋中的表达水平最高（图2a）。亚细胞定位实验表明PeTIP4-3定位于液泡膜、内质网和质膜（图S1）。此外，原位杂交结果显示PeTIP4-3主要在竹笋的维管束鞘细胞中表达（图2b-e），这与现有证据一致，即这些细胞作为水分运输的通道和水库（Liese, 1998）。通过将PeTIP4-3的1049 bp启动子序列与GUS报告基因融合，本研究探索了其表达模式。GUS组织化学分析显示，在转基因水稻幼苗的叶鞘中观察到较强的GUS染色（图2f-i）。此外，qPCR分析明确表明，与对照相比，干旱和盐胁迫处理的竹子幼苗中PeTIP4-3的表达水平显著升高（图2k,l）。另外，使用ELISA检测转基因水稻幼苗根、茎和叶中的GUS活性，发现茎中的GUS活性高于根和叶（图2j）。此外，在干旱和盐胁迫下，转基因水稻茎中PeTIP4-3启动子的活性也显著增加（图2m）。因此，本研究提出PeTIP4-3可能是参与水分运输的关键基因。PeTIP4-3过表达显著提高转基因植物对干旱和盐胁迫的耐受性本研究通过酵母表达系统初步探究了PeTIP4-3的功能。结果显示，无论是表达PeTIP4-3的重组酵母还是对照酵母，在常规固体培养基上生长相似，表明PeTIP4-3的表达对酵母增殖无影响。然而，在含有不同浓度山梨醇或NaCl的固体培养基上，重组酵母显示出更高的存活能力，表明PeTIP4-3的表达提高了转基因酵母的干旱和盐胁迫耐受性（图S2）。此外，过表达PeTIP4-3的转基因水稻（PeTIP4-3_OEs）在干旱和盐胁迫下种子发芽时间更短（图3a），发芽率更高（图3b），表明PeTIP4-3过表达增加了转基因水稻种子对干旱和盐胁迫的耐受性。为了评估PeTIP4-3_OEs的水分运输能力，本研究将PeTIP4-3_OE和野生型（WT）幼苗分别置于干旱和盐胁迫条件下14天。随着干旱和盐胁迫的持续，所有幼苗的植株高度、地上部生物量和净光合速率均显著下降，证实了水分缺乏对植物生长的影响（图3）。然而，在干旱和盐胁迫14天后，PeTIP4-3_OEs的植株高度、地上部和根部生物量以及光合能力均显著高于WT，表明干旱和盐胁迫对PeTIP4-3_OEs的影响小于WT（图3c-j，图S3A,B）。荧光参数测量进一步支持这一观点，即在干旱和盐条件下，PeTIP4-3_OEs的Fv/Fm下降幅度显著低于WT（图3k）。此外，在正常条件下，PeTIP4-3_OEs与WT之间的CAT、POD和SOD活性以及MDA含量无显著差异。然而，经过14天的干旱和盐胁迫后，PeTIP4-3_OEs的CAT、POD和SOD活性较高，MDA含量较低（P ≤ 0.05或P ≤ 0.01）（图3l,m，图S3C,D）。自然干旱和重新浇水实验进一步验证了PeTIP4-3可以提高存活率和吸水率（图S3e-g），表明PeTIP4-3过表达加速了转基因植物的水分运输。综上所述，这些结果确认了在酵母和水稻中过表达PeTIP4-3可以增强其对干旱和盐胁迫的耐受性。PeMYB99结合到PeTIP4-3启动子上以促进其转录为了揭示PeTIP4-3与其他基因的关系，本研究基于RNA-Seq数据构建了一个以PeTIP4-3为中心基因的共表达网络。结果显示，PeTIP4-3与多种转录因子（TFs）和蛋白激酶（PKs）高度相关，包括Trihelix、MYB、HDZIP、RLK和SAPK（图S4；表S5）。同时，在PeTIP4-3的启动子中鉴定出了MYB的潜在结合位点（表S6）。为了验证PeMYB99与PeTIP4-3启动子的结合，本研究进行了酵母单杂交（Y1H）和双荧光素酶报告（DLR）试验。Y1H试验结果表明，共表达pHIS2-pPeTIP4-3和融合的ADR2-PeMYB99使酵母细胞在含有30 mM 3-AT的平板上正常生长，说明PeMYB99能够结合到PeTIP4-3的启动子上（图4a）。DLR试验进一步证实了这一点，烟草叶片中共同转化35S::PeMYB99和pPeTIP4-3::LUC时，LUC活性显著高于对照（图4b）。此外，GUS试验也验证了转录激活作用，与对照相比，pPeTIP4-3::GUS与35S::PeMYB99共同转化导致GUS活性和蛋白水平显著升高（图4c,d）。这些发现表明PeMYB99是PeTIP4-3的转录激活因子。为了进一步研究PeMYB99在PeTIP4-3启动子区域的结合位点，本研究分析了起始密码子上游的1049 bp区域，鉴定出六个MYB结合基序，全部位于启动子的S1部分（图4e）。在烟草叶片中进行的DLR试验表明，共转化35S::PeMYB99和pPeTIP4-3S1::LUC导致LUC/REN比率显著升高（图4f）。选择了S1部分的三个代表性顺式作用元件进行进一步分析：MYB-motif1（50-GTTGGTT-30）、MYB-motif2（50-TTTATCC-30）和MYB-motif3（50-GCCGTTA-30）。Y1H试验确认了PeMYB99与这些基序的结合，携带相应构建体的酵母细胞在含有30 mM 3-AT的QDO平板上正常生长，而ADR2-PeMYB99和pHIS2-M-突变体以及阴性对照酵母细胞不能生长（图4g）。此外，电泳迁移率变动试验（EMSA）也显示了PeMYB99与PeTIP4-3启动子之间的直接相互作用（图S5）。PeMYB99-GST融合蛋白对PeTIP4-3探针有强烈的结合倾向，且在存在竞争性探针时结合减弱（图4h-j；表S3）。这些结果共同提供了直接证据，表明PeMYB99可以激活PeTIP4-3的表达。加权基因共表达网络分析（WGCNA）的结果揭示了PeSAPK4、PeMYB99和PeTIP4-3之间的共表达模式，引起了我们对它们之间是否存在相互作用的兴趣。为了探究这一点，本研究首先进行了酵母双杂交（Y2H）和双荧光素酶互补（DLC）试验。结果显示，只有BD7-PeMYB99和AD7-PeSAPK4共转化的实验组以及阳性对照在QDO平板上表现出正常生长，并且在30 mM X-α-半乳糖存在下呈现蓝色。然而，BD7-PeTIP4-3和AD7-PeSAPK4共转化组及阴性对照没有生长（图5a）。此外，本研究还将PeMYB99蛋白的N端区域（1-117个氨基酸）和C端区域（118-290个氨基酸）分别整合到酵母载体BD7中。结果清楚地表明，是PeMYB99-C而不是PeMYB99-N与PeSAPK4蛋白相互作用（图5a）。在烟草叶片中，当PeMYB99、PeMYB99-C和PeMYB99-N与LUC的N端半部分融合（PeMYB99::nLUC、PeMYB99-N::nLUC和PeMYB99-C::nLUC），并与融合有LUC C端半部分的PeSAPK4（PeSAPK4::cLUC）共表达时，观察到了荧光素酶活性。因此，在含有PeMYB99::nLUC和PeSAPK4::cLUC以及PeMYB99-C::nLUC和PeSAPK4::cLUC的区域检测到了强烈的发光信号，而在含有空载体或PeMYB99-N::nLUC和PeSAPK4::cLUC的区域没有检测到信号（图5b-d）。首先，本研究分析了PeSAPK4和PeMYB99的亚细胞定位，结果显示它们共同定位于烟草叶片表皮细胞的细胞核中（图S6）。随后，本研究使用双分子荧光互补实验（BiFC）、免疫共沉淀（Co-IP）和pull-down试验来分析PeSAPK4和PeMYB99之间的相互作用。构建了PeSAPK4::YFPC和PeMYB99::YFPN载体，并将其转入农杆菌中，然后注射到烟草叶片中。共聚焦显微镜分析表明，PeSAPK4和PeMYB99在细胞膜上发生相互作用（图5e）。Co-IP结果表明，在Input组和MYC-IP组中用抗HA抗体检测到了目标条带，而在对照组中未检测到，说明PeSAPK4与PeMYB99相互作用（图5f）。为进一步验证这一相互作用，进行了体外GST pull-down试验，使用了从大肠杆菌BL21表达和纯化的重组His-PeSAPK4和GST-PeMYB99蛋白。结果表明，是His-PeSAPK4而非GST本身与GST-PeMYB99蛋白相互作用（图5g）。此外，使用NetPhos 3.1服务器预测了PeMYB99的磷酸化位点，预测了五个潜在位点（评分>0.85；表S7），提示这些位点可能被PeSAPK4靶向。鉴于PeSAPK4的蛋白激酶特性，本研究在大肠杆菌BL21中通过激酶试验测试了PeSAPK4和PeMYB99之间的激酶-底物关系。如图5h所示，GST-PeMYB99被His-PeSAPK4磷酸化。综上所述，这些结果证实了PeSAPK4能够与PeMYB99相互作用并对其进行磷酸化。PeSAPK4-PeMYB99复合体协同激活PeTIP4-3为了进一步探究PeSAPK4-PeMYB99复合物对PeTIP4-3的调控作用，本研究将35S::PeSAPK4与35S::PeMYB99的组合共同转化到烟草叶中，并与pPeTIP4-3::LUC一起进行转化。结果显示，PeSAPK4_PeMYB99复合物对PeTIP4-3的表达增强程度高于单独的PeMYB99，这一结果得到了LUC互补成像实验的支持（图6a–c）。本研究还进行了GUS组织化学和GUS酶活性实验以进一步支持这一结果。构建了三个载体（35S::PeMYB99、35S::PeSAPK4和pPeTIP4-3::GUS），并共同转化到烟草叶中。共同表达PeMYB99、PeSAPK4和pPeTIP4-3的叶片相比共同表达PeMYB99和pPeTIP4-3的叶片表现出更高的GUS活性（图6d,e）。这些发现表明，PeSAPK4直接与PeMYB99相互作用，并且PeSAPK4_PeMYB99复合物促进了PeTIP4-3的转录。过表达PeMYB99和PeSAPK4增强了转基因水稻的抗旱和抗盐能力为了验证PeMYB99和PeSAPK4的功能，本研究进行了定量聚合酶链反应（qPCR），分析了毛竹不同组织、不同发育阶段的竹笋以及干旱和盐胁迫下幼苗中的表达模式。结果表明，PeMYB99和PeSAPK4在六个组织中均有表达，其中在竹笋和根中表达水平较高（图S7A-B）。进一步的结果显示，PeMYB99和PeSAPK4在不同发育阶段的竹笋中有相似的表达模式。此外，与对照组相比，干旱和盐胁迫下毛竹幼苗中的PeMYB99和PeSAPK4表达水平显著升高（图S7C-I）。为了更深入地了解它们的功能，本研究将PeMYB99和PeSAPK4过表达在水稻中。种子萌发试验表明，转基因系（PeMYB99_OEs和PeSAPK4_OEs）并没有提高种子对干旱和盐胁迫的耐受性（图7a）。然而，经过14天的干旱和盐胁迫后，PeMYB99_OEs幼苗的高度显著高于野生型（WT），在干旱胁迫下，PeSAPK4_OEs幼苗也有类似的结果（图7b-d）。此外，PeMYB99_OEs和PeSAPK4_OEs幼苗的表型特征和光合作用生理指标也显著优于WT（图7e-i）。在干旱和盐条件下，PeMYB99_OEs和PeSAPK4_OEs幼苗的Fv/Fm值显著低于WT（图7j）。此外，生理指标也支持这些结果。在正常条件下，转基因和WT之间的过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）活性以及丙二醛（MDA）含量没有显著差异。然而，在经过14天的干旱和盐胁迫后，PeMYB99_OEs和PeSAPK4_OEs幼苗的CAT、POD和SOD活性更高，MDA含量更低，与WT相比有显著差异（P ≤0.05或P ≤0.01）（图7k-m，图S8A-B）。此外，与WT相比，干旱和盐胁迫下，两种转基因系中的三个OsTIPs（OsTIP1;2、OsTIP2;2和OsTIP4;1）的表达上调（图S9），并且在这些OsTIPs的启动子中鉴定出了MYB结合基序。这些发现提供了证据，表明PeMYB99和PeSAPK4可以通过促进转基因水稻幼苗中OsTIPs的转录来增强对干旱和盐胁迫的耐受性。ABA介导的PeSAPK4-PeMYB99-PeTIP43调控水分运输在前一部分中识别出的“PeSAPK4-PeMYB99-PeTIP4-3”调控模型暗示了在转基因水稻的干旱和盐耐受性中存在一条正向调控途径。为了探讨这一问题，本研究对外源脱落酸（ABA）处理的毛竹幼苗以及野生型和转基因水稻（PeTIP4-3_OEs、PeMYB99_OEs和PeSAPK4_OEs）的种子和幼苗进行了定量聚合酶链反应（qPCR）分析。结果表明，与对照组相比，ABA处理的毛竹幼苗中PeTIP4-3、PeMYB99和PeSAPK4的表达量有更高的增加（图S10）。种子萌发试验显示，过表达PeTIP4-3、PeMYB99和PeSAPK4并未提高转基因水稻对ABA的耐受性（图8a）。然而，在ABA处理14天后，转基因水稻的幼苗生长特性优于野生型（WT）（图8b-f）。为了进一步研究ABA对“PeSAPK4-PeMYB99-PeTIP4-3”模型的调控作用，将35S::PeMYB99与pPeTIP4-3::LUC或35S::PeSAPK4和35S::PeMYB99与pPeTIP4-3::LUC共转化到烟草叶片中，然后用ABA溶液或水处理这些叶片。结果表明，在ABA溶液存在下，与仅用水处理相比，在共转化有35S::PeSAPK4、35S::PeMYB99和pPeTIP4-3::LUC的叶片中检测到PeTIP4-3的转录增强，而在仅共转化有35S::PeMYB99和pPeTIP4-3::LUC的叶片中未观察到这种现象（图8g-j）。这些结果表明PeSAPK4是一种ABA依赖性激酶。因此，提出了一种由ABA介导的PeSAPK4-PeMYB99-PeTIP4-3，在调控水分运输中发挥作用（图9）。竹子作为一种非木材森林资源，因其优良的木质特性和快速生长而受到广泛关注。过去二十年中，竹子的育种、栽培和木材特性研究取得了显著进展，有助于缓解木材短缺问题。然而，竹子在快速生长期需要大量水分，其浅根系使其对干旱胁迫敏感，缺水会阻碍竹笋发育甚至导致竹林大面积死亡。因此，理解水分运输的复杂机制对于培育抗旱竹种以满足日益增长的木材需求至关重要。植物生长依赖于细胞增殖和扩张，这需要持续的水分吸收来维持膨压。虽然植物通常在白天生长更为旺盛，可能与蒸腾作用的日间调节有关，但竹笋表现出夜间生长迅速的现象，这归因于夜间根压维持竹笋的膨压。研究发现，水通道蛋白（AQPs）的mRNA表达与细胞扩张相关。在拟南芥根中，水含量随昼夜节律变化，而PIP表达在傍晚下降，表明晚上可能通过其他AQPs进行水分运输。本研究发现竹笋中PeTIP4-3的表达与昼夜周期中的根压波动平行，推测其在水分运输中起关键作用。PeTIP4-3在竹笋的维管束鞘细胞中高表达，且其启动子活性在转基因水稻的茎中较高，表明它是竹笋水分运输的关键基因。过表达PeAQPs已被证明能增强拟南芥和酵母的抗旱性。本研究中，PeTIP4-3在干旱和盐胁迫下表达上调，过表达PeTIP4-3显著提高了酵母和水稻幼苗的抗旱和耐盐性，与之前在拟南芥中的研究一致。此外，TaPIP2;10在小麦中被报道通过促进二氧化碳运输来增强光合作用和产量。综上所述，PeTIP4-3在水分运输中起着关键作用。MYB转录因子在植物应对水分不足中发挥重要作用。先前研究显示，过表达OsMYBR57可提高水稻的抗旱性。然而，MYB在调控竹子水分运输中的具体功能尚不明确。本研究基于转录组数据鉴定出与PeTIP4-3共表达的竹子MYB基因PeMYB99，其在干旱和盐胁迫下表达上调。过表达PeMYB99显著提高了转基因水稻幼苗在干旱和盐胁迫下的株高、根系生长和生物量，与在其他植物中的研究结果相似。MYB蛋白可通过直接结合目标基因的顺式调控元件来调节基因表达。本研究在PeTIP4-3启动子中鉴定了三个新的MYB顺式元件基序，并通过酵母单杂交和电泳迁移率变动试验验证了PeMYB99可直接结合这些基序。此外，过表达PeMYB99的水稻中OsTIPs的表达在干旱和盐胁迫下上调。因此，PeMYB99作为调控水分运输的关键调节因子，在干旱和盐胁迫下通过上调PeTIP4-3的表达来增强水分运输能力。进一步研究了PeMYB99和PeTIP4-3的转录后调控机制。已知MYB蛋白的互作伙伴，如组蛋白去乙酰化酶、MAP激酶、SnRKs和小RNA，会影响MYB的活性或功能。此外，MYB蛋白的磷酸化在应激响应中的活性调节中起作用。因此，本研究探讨了PeMYB99和PeTIP4-3在水分运输中的磷酸化调控机制。最近的研究表明，SnRK2s通过磷酸化VARICOSE和相关蛋白调节根生长，并通过影响AQPs的转录水平在盐胁迫下影响根发育。本研究中，鉴定了竹子中的SnRK2成员PeSAPK4，它能与PeMYB99相互作用。双荧光素酶报告基因 assay和GUS活性分析显示，PeSAPK4和PeMYB99协同增强PeTIP4-3的转录。可能的机制包括PeSAPK4_PeMYB99复合物通过改变蛋白构象或增强与PeTIP4-3启动子中顺式元件的结合能力来促进转录。体外磷酸化实验表明PeSAPK4可磷酸化PeMYB99，推测PeSAPK4通过磷酸化PeMYB99来完全激活其转录激活功能，从而激活PeTIP4-3的转录，进而调控竹子的水分运输。过去几十年中，植物对干旱和盐胁迫的响应机制得到了广泛研究，包括气孔关闭、渗透调节和ABA合成等。SnRKs在调控ABA诱导的基因表达中起关键作用，SnRK2s与下游蛋白直接互作，保持激酶的磷酸化状态和活性。本研究发现，竹子中的SnRK2成员PeSAPK4在ABA处理下强烈诱导表达，过表达PeSAPK4显著提高了转基因水稻幼苗的ABA耐受性。此外，证实了PeSAPK4通过ABA介导的信号促进PeTIP4-3的转录。基于这些发现和先前的研究，提出了一条由ABA介导的PeSAPK4-PeMYB99-PeTIP4-3，调控竹子在干旱和盐胁迫下的水分运输。总之，本研究揭示了PeSAPK4通过与PeMYB99互作，响应ABA诱导PeTIP4-3的表达，从而提高抗旱和耐盐性。这些发现为利用PeTIP4-3的上游调控基因改善竹子的抗旱和耐盐性提供了有价值的信息，并为其他植物品种的遗传改良提供了可行策略。Zhu, C.; Lin, Z.; Yang, K.; Lou, Y.; Liu, Y.; Li, T.; Li, H.; Di, X.; Wang, J.; Sun, H.; et al. A Bamboo ‘ PeSAPK4‐PeMYB99‐ PeTIP4‐3 ’ Regulatory Model Involved in Water Transport. New Phytologist 2024, 243, 195–212, doi:10.1111/nph.19787.电泳迁移率变动试验（Electrophoretic Mobility Shift Assay, EMSA），也称为凝胶迁移率变动试验（Gel Shift Assay），是一种常用的分子生物学技术，用于检测DNA-蛋白质相互作用。在研究转录因子与基因启动子之间的相互作用时，EMSA可以提供直接的证据来证明它们之间的特异性结合。
以下是使用EMSA证明转录因子和基因启动子之间相互作用的基本步骤：
制备探针：首先，需要合成或扩增包含潜在转录因子结合位点的DNA片段，这个片段被称为探针。探针通常会被放射性同位素（如32P）或非放射性标记物（如生物素）标记，以便于检测。
制备蛋白质提取物：从表达目标转录因子的细胞中提取核蛋白或粗提物，这些提取物中含有待测试的转录因子。
进行EMSA反应：将标记的DNA探针与蛋白质提取物在体外混合，通常在含有竞争性DNA（如聚脱氧核糖核酸，poly(dI-dC)）的缓冲液中，以减少非特异性结合。反应混合物在室温下孵育一段时间，让蛋白质与DNA探针结合。
电泳分离：将反应混合物加载到非变性聚丙烯酰胺凝胶上，通过电泳分离。由于结合了蛋白质的DNA探针分子量增加，其在凝胶中的迁移速率会减慢，因此在凝胶上形成的位置相对于自由的DNA探针更慢。
检测结合复合物：电泳结束后，通过放射自显影、化学发光或其他检测方法来可视化标记的DNA探针。如果转录因子与DNA探针结合，会形成一个迁移较慢的复合物带，与自由的DNA探针分开。
竞争分析：为了确认结合的特异性，可以加入过量的未标记的竞争性DNA探针，看是否能置换掉结合在标记探针上的转录因子。特异性的竞争可以用来确定结合位点的序列特异性。
超移分析：有时，为了进一步验证结合的特异性，可以使用特异性的抗体进行超移分析（Supershift Assay）。如果加入针对转录因子的抗体，结合复合物会被进一步捕获，导致其在凝胶上的迁移速率进一步减慢，形成新的带型，这可以作为转录因子特异性结合的额外证据。
