本研究对拟南芥（Arabidopsis thaliana）种子萌发过程中的胚胎进行了单细胞分辨率的时间分析，揭示了细胞类型特异性基因表达动态及其与细胞功能变化的关系。发现萌发初期，大多数胚胎细胞经历相同的初始转录状态，随后转变为细胞类型特异性表达模式。研究支持萌发早期事件始于维管系统的观点，为探究不同基因型和其他植物种子的萌发策略提供了通用框架。
前言
种子萌发是种子开始生长并适应环境的过程，对农业生产至关重要。萌发需监测内外条件，确保适宜生长时机。种子结构复杂，包含多种组织和细胞类型，其功能与生化特性实现生长和发育的时空控制。温度变化由休眠拟南芥种子的胚根和胚乳细胞感知并触发萌发。萌发初期，细胞扩张驱动生长，基因表达受精确调控。成熟胚胎细胞核在种子发育末转为异染色质状态，抑制基因表达，适应干燥。吸水后核逆转为常染色质，启动转录。萌发初期依赖储存转录本的翻译，但新生转录也早期发生。转录因子级联调控基因表达，影响萌发速率。DNA甲基化和小RNA在萌发中变化，参与基因调控。单细胞分辨率研究揭示，细胞先经历共享早期转录状态，再转为细胞类型特异性状态，反映功能变化。构建了基因调控模型，预测关键转录因子。研究深入理解了幼苗建立过程中的调控机制。
主要结果
萌发胚胎单细胞表达图谱的构建
本研究旨在解析拟南芥（Arabidopsis thaliana）萌发胚胎中不同细胞类型的基因表达差异及其调控机制。通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）构建了萌发胚胎的转录图谱（图1）。首先，通过萌发实验确定了基线动态，选取12、24和48小时三个时间点（图1a,b）。胚胎细胞原生质体分离后进行scRNA-seq，并校正分离技术影响（图1c-e）。利用10X Genomics平台分析转录组，获得12,798个Col-0细胞数据（扩展数据图1）。细胞聚类分析显示15个转录特征相似的细胞簇（图2a），随时间变化显著（图2b），反映细胞状态而非类型的变化。实验重复性良好，细胞簇比例略有差异，可能与基因表达动态相关。
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表达图谱中的细胞类型注释
本研究对胚胎单细胞图谱中的细胞簇进行了注释，以便解释萌发过程中的变化（图2c）。由于缺乏全面的参考数据集，我们通过文献研究确定了相关标记基因，并与特定簇中表达的基因进行比对。成功推断出13个细胞簇的身份（图2c,d），包括子叶（中叶（簇3和13））、下胚轴（皮层（簇1、5和7）、表皮（簇6）和皮层/内皮层（簇2））和胚根（表皮（簇10）、胚根顶端分生组织（簇14）和静止中心/柱细胞（簇4））。
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在48小时时间点检测到主要的原生细胞类型（原生韧皮部（簇15）、原生木质部（簇9）和原生细胞（簇12））。簇8和11无法归因于已知细胞类型。未能检测到明显的芽顶端分生组织簇，可能因为这些细胞相对较少。通过RNA原位杂交验证了簇9和簇14的注释（图3）。这些结果与随时间变化的簇检测情况一致，进一步说明了萌发过程中细胞转录组的动态性质。
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胚胎细胞经历广泛的转录重编程
随着萌发的进行，胚胎内单个细胞的生长特性和发展会发生变化。本研究调查了动态基因表达如何影响细胞功能属性的变化，以及这与观察到的转录状态的关系。研究重点放在下胚轴皮层细胞上，因为这些细胞在萌发的不同时间点被检测为三个不同的簇（1、5和7）（图4）。簇5细胞在12小时时最丰富，伴随少量的簇1细胞（图4a）。簇1和7细胞在24小时时最丰富，而在48小时时，任何簇中检测到的细胞都很少，但簇1细胞最丰富（图4a）。下胚轴皮层细胞的三个不同簇表明存在转录组不同的下胚轴皮层细胞群体。无法明确识别特定簇的单个标记转录本，表明簇之间的差异相对细微，与许多基因表达的定量差异有关，而不是某些转录本的存在与否（扩展数据图3和补充表6）。然而，簇1、5和7共有的标记转录本很容易识别（扩展数据图4和补充表7）。AT4G16410是我们scRNA-seq数据中12小时和24小时时间点的簇1、5和7的特异性标记转录本。通过RNA原位杂交检测到12小时和24小时时下胚轴中部和下部皮层细胞中的转录本表达，证实了簇1、5和7的细胞类型注释（图4b和扩展数据图5）。对三个下胚轴皮层簇（1、5和7）中的细胞转录组进行了详细分析，以了解它们的相似性和差异。对注释为下胚轴簇（1、2、5、6、7和10）的细胞进行了新的降维分析，以消除其他器官或组织中细胞转录差异的影响，从而允许我们专注于下胚轴细胞之间的较小差异（图4c）。下胚轴皮层簇的细胞在这个聚焦尺度上再次形成了一个连续的组，证实了簇1、5和7的转录组高度相似（图4c）。组的时序顺序得到保留，从12小时收获的细胞（簇5）过渡到24小时（簇7和1）再到48小时（簇1；图4a）。这些观察表明，簇1、5和7代表了萌发过程中随时间推移经历不同转录状态的下胚轴皮层细胞。通过将下胚轴皮层细胞组装到伪时间轨迹上，进一步检验了簇1、5和7代表萌发不同阶段下胚轴皮层细胞的假设。单个胚胎内的单个细胞类型在萌发过程中在不同时间开始活跃，启动动态基因表达程序。因此，单个细胞类型的细胞分布在共享的基因表达发育轨迹上，每个细胞处于略微不同的表达状态。此外，在均匀条件下萌发开始的确切时间在遗传上相同的种子之间有所不同。我们实验中的每个样本都是数百个胚胎的混合物。因此，每种细胞类型的许多细胞将存在于我们的每个样本中，这些细胞将分布在该细胞类型发育轨迹的连续体上。这种实验设计是有利的，因为它允许我们使用称为伪时间分析的技术重建基因表达的发育轨迹。伪时间分析根据细胞的表达状态对单细胞实验中的细胞进行排序，从而进行发育进程。在我们的情况下，早期伪时间应对应于早期萌发，晚期伪时间对应于晚期萌发，细胞在这些点之间的连续体上进行排序。这种细胞排序使得能够检查基因表达在萌发过程中如何动态变化。伪时间轨迹的重建支持了簇1、5和7代表萌发不同阶段下胚轴皮层细胞的观点，伪时间遵循与实际萌发时间相似的路径（图4c）。此外，下胚轴皮层细胞簇中转录组的动态变化表明这些细胞的功能属性在萌发过程中发生变化。为了研究这一点，我们确定了共表达基因的模块，并评估了它们的功能和表达时间。在簇1、5和7的伪时间轨迹上有25个不同的共表达基因模块（图4d和补充表8）。这些模块在伪时间轨迹上大致分为早期（模块4、6、11、12、14、15、17和24）、中期（1、2、5、19、20和22）和晚期（3、7、8、9、10、13、16、18、21、23和25），可以认为是相当于早期、中期和晚期萌发。早期萌发期间共表达的基因富含与染色质可及性、转录、RNA剪接和翻译相关的功能；中期萌发期间，与翻译、蛋白质成熟和光合作用相关的功能更为明显；而在晚期萌发中，光合作用是主要功能。这些分析表明，动态基因表达驱动了下胚轴皮层细胞在萌发过程中的功能变化。萌发早期建立初始细胞转录状态
研究探讨了细胞在开始活动时如何建立初始转录状态。12小时萌发时间点主要由簇8和11的细胞主导（分别占12小时捕获细胞的26.74%和37.27%；图5和扩展数据图1f）。簇8和11的存在随萌发时间点动态变化。簇8细胞与1和6小时 bulk seeds的转录组高度一致，而簇11细胞则不然，表明两者生物学特性不同。通过RNA原位杂交确定了簇8和11细胞的物理位置。簇8标记转录本（AT4G25140和AT5G35660）在12小时时在整个胚胎中表达（图5c和扩展数据图5），而在1和6小时也检测到相同的全胚胎表达模式（图5c和扩展数据图5）。相反，簇11标记转录本（AT1G27130和AT5G10520）仅在1、6和12小时的原始维管束细胞中检测到（图5d和扩展数据图5），这与脱落酸和赤霉素信号的区域相对应，调控休眠种子的萌发决策。综上，簇8代表胚胎大多数细胞在萌发早期经历的一般转录状态，而簇11代表决定萌发的细胞群体，具有与其他细胞不同的早期转录状态。
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每种细胞类型中活跃着独特的基因调控程序
在萌发过程中，胚胎中的不同细胞类型扮演不同角色，并在不同时间点对萌发的成功做出贡献。每种细胞类型都具有独特的功能属性，这些属性由细胞表达的特定基因组合决定。因此，萌发胚胎的每种细胞类型都应该有一个独特且动态的基因调控程序。通过分析基因表达动态和预测每个细胞簇（即细胞类型或状态）的转录因子，研究了这些基因调控程序的性质（图6，扩展数据图6-9和补充表10-14）。使用了连续状态隐马尔可夫模型—转录因子（CSHMM-TF）方法，因为它能够组装伪时间轨迹，从中可以分析表达动态，并预测哪些转录因子是观察到的基因表达动态的假定调节因子。CSHMM-TF基于转录因子的表达及其靶基因的表达来预测调节转录因子。这是通过整合转录因子结合数据实现的，这里提供的是来自全基因组体外蛋白质-DNA结合测定的>500个拟南芥转录因子的实验验证靶基因。CSHMM-TF还确定了在伪时间过程中细胞基因表达显著分歧的位置，将具有不同表达状态的细胞分到不同的路径上，这可能在簇内指示细胞亚群。![]()
基因表达在所有细胞簇的萌发过程中都是动态且复杂的。每个簇在萌发过程中都表现出独特的基因共表达模式，表达基因的功能注释在萌发过程中发生变化，这表明细胞生物学属性的变化（图6a，扩展数据图5和补充表10和11）。例如，簇8细胞（早期萌发细胞状态）首先表达参与能量资源利用（ATP和油体；路径P0）的基因，然后是RNA加工、翻译和缺氧（路径P1）。能量生物学功能的最早表达可能表明代谢的启动，当线粒体功能重新建立时，代谢的恢复将导致在萌发这一阶段的缺氧特征。与此一致，水稻和大麦谷物在萌发的最早阶段表达相似的功能。然后细胞沿着两个基因表达路径分裂，路径P2细胞表达参与mRNA代谢和能量生物学的基因，但路径P3/P4细胞表达更多的蛋白质加工和翻译功能。簇11细胞（萌发决策中心）的基因表达模式与簇8不同（图6a和补充表10和11）。例如，与缺氧相关的基因在簇11模型的最早期阶段（P0）就已经表达。这将是与簇11细胞的代谢更早变得活跃一致的，正如在首先做出萌发决定的细胞中所预期的那样。簇11细胞然后沿着三个基因表达路径（P1、P2/3和P4）分裂，其中两个（P1和P2/3）的特征是涉及翻译和核糖体生物发生的功能表达。对于簇8和11，伪时间排列与细胞的实际萌发时间一致（图6a）。所有簇在萌发过程中都观察到类似复杂和独特的基因表达模式，表明基因调控程序在各个簇之间有所不同，因此在不同细胞类型或状态之间也有所不同（图6，扩展数据图6-9和补充表10-14）。![]()
不同的基因调控程序需要不同转录因子的活性。首先比较了我们的模型预测的簇8和11的基因调控程序的候选调节转录因子。在15个预测的调节转录因子中，有7个是簇8特有的，而有23个是簇11特有的，8个在两个簇之间共享（图6a）。其中一些转录因子有先前证据表明它们参与萌发或幼苗早期生长。在簇之间共享的转录因子中有油菜素内酯激素响应的调节因子（BIM2；AT1G69010，BEH3；AT4G18890和BEH4；AT1G78700），这是值得注意的，因为油菜素内酯在细胞分裂和生长中起着重要作用。簇8特有的三个转录因子在胚胎发育、种子成熟和脂质积累中有功能（AREB3；AT3G56850，FUSCA3；AT3G26790和HSF3；AT5G16820）。簇8特有的另一个转录因子（GT-1；AT1G13450）促进光响应基因表达，这与种子最近暴露于光作为萌发触发因素一致。簇11特有的转录因子ERF55/透明绿色（TG；AT1G36060）抑制光诱导的种子萌发。其他转录因子在粘液生产和根毛生长（DF1；AT1G76880）中有作用，这发生在萌发的早期，以及钙信号传导（CAMTA1；AT5G09410和CAMTA5；AT4G16150）和生长素介导的形态发生（HAT2；AT5G47370），这两个都是影响种子发育和萌发的信号通路。这些分析表明，簇8和11的细胞执行不同的基因调控程序，涉及不同的转录因子集合。通过突变编码这些转录因子的基因，评估了模型作为预测影响萌发表型转录因子的工具的效用。分析重点关注簇8（15个中的7个）和簇11（23个中的15个）的预测调节转录因子。获得了导致同源突变的转移DNA（T-DNA）片段，这些突变预期会破坏簇8（四个独立的T-DNA片段破坏三个基因：areb3对于AREB3，gt1-1和gt1-2对于GT1，hsf3对于HSF3）和簇11（七个独立的T-DNA片段破坏五个基因：dof5.8对于AT5G66940，tg-1和tg-2对于TG，tga6和tga61对于TGA6（AT3G12250），tga9对于TGA9（AT1G08320）和wrky3对于AT2G03340；补充表15）的转录因子启动子或编码序列。这些基因是根据拟南芥生物资源中心提供的针对基因预期区域的单插入突变导致系的可用性而被选择进行分析的。从每个T-DNA片段的两个亲本线收集后代进行定量PCR与反转录（qRT-PCR）分析，以确认目标基因的敲除或敲低。结果表明，针对AREB3、HSF3、GT1和DOF5.8的片段导致基因的敲低，而针对TGA9、WRKY3、TG和TGA6的片段导致基因的敲除。GT1的第二等位基因，其中T-DNA的插入位于启动子区域，导致该基因在突变体中过表达（扩展数据图10a）。突变植物的萌发率（通过种皮破裂确定）与野生型Col-0在24小时光照暴露后进行了比较，跨越四个独立的生物学重复（图6b）。所有影响八个转录因子中的四个的突变的萌发率都更快（AREB3、GT1、TGA9和WRKY3）。对于簇8，areb3、gt1-1和gt1-2突变体的所有后代系的萌发率始终更快。hsf3后代系的萌发率不一致。对于簇11，tga9和wrky3的所有后代系的萌发率始终更快，而dof5.8的萌发率与野生型没有差异。tg-1表现出增加的萌发率，但tg-2没有，这表明同一基因中这两个突变的效果不同。在一个tga6后代系中，萌发率增加，两个tga6-1后代系中萌发率也增加，这可能是由于tga6的相对较弱表型效应。总的来说，这些结果表明，当通过突变编码基因来改变时，我们的建模方法能够识别影响萌发表型的转录因子。还研究了突变编码预测调节转录因子的基因对全局基因表达的影响。选择了一组突变体来代表一系列表型：areb3和wrky3对萌发率有强效影响；tg-1有中等影响；hsf3和tga6有弱或不一致的影响（图6b；选定的行以红色表示）。使用bulk RNA-seq在萌发24小时时将这些突变体的转录组与野生型植物的转录组进行了比较（图6c和补充表16）。目标突变基因的表达值与每行的qRT-PCR结果一致。萌发率显著增加的突变体areb3和wrky3也有最多的差异表达基因（DEG）（areb3为859个，wrky3为959个），而tg-1中只有31个基因失调。突变体之间的DEG有大量且显著的重叠（扩展数据图10b,c；P < 1 × 10−5；超几何检验），这与受影响的相似基因网络和加速萌发的共同效应一致。areb3突变体中下调的基因显著富集了AREB3转录因子的靶标（来自536个总已知AREB3靶标的369个DEG中的27个；P < 1 × 10−5；超几何检验），但其他突变体的DEG没有显著富集那些转录因子的已知靶标。总的来说，这些差异表达结果与早期萌发表型相结合，表明AREB3和WRKY3可能在萌发过程中影响基因表达，进一步支持我们的建模方法的效用。由于我们预计这些转录因子在定义的细胞子集中和特定讨论
在种子生物学中，关于基因表达模式如何在单个胚胎细胞中建立和变化的问题尚未得到解答。本研究全面描述了拟南芥胚胎单个细胞在萌发12至48小时内的基因表达动态。
观察到基因表达在单个细胞类型内高度动态，并且随着萌发的进行，细胞经历了不同的转录状态。最早检测到的特异性转录活性位于根尖中，支持将该区域定义为萌发决策中心。除此之外，几乎所有其他胚胎细胞在萌发开始时都经历了一个共同的转录状态。这从我们的观察中可以看出，超过三分之一的细胞在萌发12小时属于一个单独的簇（簇8），并且在用RNA原位杂交观察时，该簇的标记转录本在胚胎中广泛表达。
我们可以排除12小时时观察到的转录组复杂性降低是由于欠采样，因为此时点的细胞每细胞读数最多，测序饱和度最高。此外，来自后期时间点的具有类似低UMI计数的细胞从早期萌发簇中分离出来。这证实了12小时时细胞的RNA含量确实较低，并且比后期时间点更加均一。随后，胚胎的许多细胞类型特异性基因表达程序出现。为什么细胞在首次活动时需要表达这个共享的转录程序还有待发现，特别是考虑到它们的细胞身份已经在胚胎发生过程中已经确定。从共同基态中出现专门的转录状态也提出了一个问题，即在胚胎发育和种子干燥后，哪些因素提供了细胞身份的记忆。这些因素可能包括在低丰度存储的特定mRNA、存储的转录因子或细胞类型之间保留的表观遗传差异。
随着萌发的进行，每个胚胎细胞类型的转录组发生了显著变化，导致每个细胞类型随时间表达的分子途径和功能发生变化。下胚轴皮层细胞就是这种情况的一个例子，在萌发的早期表达参与mRNA剪接和转录功能的基因，在中期萌发进展到蛋白质成熟和光合作用的建立，然后在种子-幼苗过渡发生的后期萌发中表达叶绿体组织和细胞生长的基因。在每种细胞类型中都观察到了类似的动态，但在每种情况下，表达的功能和变化的顺序都是特定于单个细胞类型的。这可能是反映了每个胚胎细胞类型在萌发期间独特的角色。在这些表达动态背后是细胞类型特异性的基因调控网络，由转录因子组定义。尽管一些转录因子被预测在多个细胞类型中活跃，但一部分转录因子是特定于单个细胞类型或转录状态的。这表明，随着萌发的进行，不同的转录因子组控制着每个胚胎细胞类型的动态功能变化。来自两个簇（簇8（共同转录状态）和簇11（萌发决策中心））的一组转录因子的突变导致了更快的萌发。这表明在簇8和11中表达的基因富含在萌发最早阶段活跃的萌发抑制剂。虽然从表面上看，在萌发过程中诱导编码萌发抑制剂的基因可能似乎与直觉相反，但这可以通过那些基因经历反馈抑制来解释。在这种情况下，萌发抑制剂基因的转录增加将导致其活性的抑制。反馈抑制在许多萌发基因中是常见的，并且有充分的文献记载，包括赤霉素合成、降解和响应的许多成分。这些观察结果还突出了仅凭转录本丰度无法预测基因功能。在萌发程序早期阶段诱导萌发抑制剂可能代表了一种值得进一步研究的调控机制。总的来说，我们说明了胚胎细胞随着萌发的进行而经历特定的转录状态。这使得单个细胞类型能够在适当的时间表达定义那些细胞类型变化功能的基因，从而有助于成功的种子-幼苗过渡。种子结构和资源在不同植物物种之间存在显著差异，需要不同的细胞类型、功能和动态。
我们的研究为分析物种间种子功能变异提供了一个框架，并用于研究不同物种如何在胚胎中建立细胞转录状态。本研究的交互式图谱版本，可在此处访问：https://scgerminationatlas.latrobe.edu.au/，可以作为未来详细研究萌发和细胞类型的资源。
文献来源：
Liew, L.C.; You, Y.; Auroux, L.; Oliva, M.; Peirats-Llobet, M.; Ng, S.; Tamiru-Oli, M.; Berkowitz, O.; Hong, U.V.T.; Haslem, A.; et al. Establishment of Single-Cell Transcriptional States during Seed Germination. Nat. Plants 2024, 10, 1418–1434, doi:10.1038/s41477-024-01771-3.
