本研究探讨了植物如何利用表型可塑性（phenotypic plasticity）适应环境，但在大规模农业中，这种可塑性可能导致经济性状（如营养生长和开花时间）因环境变化而大幅波动，影响收获预测和作物一致性。我们通过操控植物对环境信号的反应信号系统，限制表型可塑性和生物钟（circadian）调控。
数学模型预测，当操控生物钟和光信号通路时，植物对环境变化的反应会减少。我们利用植物光受体光敏色素B（phytochrome B）的恒定活性等位基因，并通过突变EARLY FLOWERING3破坏生物钟系统，验证了这一预测。
结果显示，这些改造植物对光和温度信号的反应减弱，无法预判黎明，表现出均匀的营养生长和开花时间。这一发现对未来开放田地和控制环境下的农业具有重要意义。
前言
表型可塑性（phenotypic plasticity）使植物能够适应环境中的微小生态位，但在现代农业中，这种可塑性可能导致生长不均匀和收获时间不可靠。植物对光和温度信号的反应受时间影响，光传感器和温度传感器与生物钟系统（circadian system）协同工作，提供相对于黎明和黄昏的内部时间参考（Millar, 2016; Sanchez et al., 2020; Kerbler and Wigge, 2023）。植物的生物钟系统整合光和温度信号，以调节发育，涉及多种光受体，包括光敏色素（phytochromes）、隐花色素（cryptochromes）和其他相关蛋白（Somers et al., 1998, 2004; Fehér et al., 2011; Webb et al., 2019; Sanchez et al., 2020）。光敏色素被认为通过选择不同的启动子来改变基因表达，并可能作为转录抑制因子（Chen et al., 2014; Jung et al., 2016; Ushijima et al., 2017; Balcerowicz et al., 2021）。光敏色素B（phyB）与早开花3（EARLY FLOWERING3, ELF3，这名字好直接）相互作用，后者在生物钟系统中起重要作用（McWatters et al., 2000; Covington et al., 2001; Liu et al., 2001; Thines and Harmon, 2010; Huang et al., 2016a）。ELF3最初是通过突变筛选发现的，具有加速开花的特性，并被认为对维持恒定光照下的生物节律至关重要（Hicks et al., 1996; Zagotta et al., 1996）。
研究表明，恒定光照下生物节律的抑制与光信号的生物节律调控丧失有关（McWatters et al., 2000; Thines and Harmon, 2010）。ELF3是晚间复合体（Evening Complex）的重要组成部分，能够调节基因表达（Nusinow et al., 2011）。高阶突变分析和全基因组研究表明，phyB和ELF3在调节胚轴长度和开花时间方面具有叠加作用（Reed et al., 2000; Ezer et al., 2017），而phyB突变加剧了elf3-12幼苗的生物节律自由运行周期缩短（Kolmos et al., 2011）。ELF3和phyB对温度敏感，并参与生物节律和光感知（Jung et al., 2016, 2020; Legris et al., 2016）。尽管phyB和ELF3相互结合，但我们仍不清楚它们如何相互作用以维持生物节律和调节植物发育（Liu et al., 2001; Huang et al., 2016a）。
本研究修订了生物钟系统的数学模型，以更好地解释phyB和ELF3的相互作用，并利用phyB的恒定活性等位基因（Y276/H [YHB]）与ELF3的缺失等位基因结合，探讨这些植物感知系统的关键组分是否可以被工程化以限制对环境信号的反应。
主要结果
建模细化了我们对光输入昼夜节律系统的理解
研究表明，光敏色素B（phyB）和早开花3（ELF3）信号通路在遗传上是可分离的，但它们之间存在功能性相互作用（Reed et al., 2000; Covington et al., 2001; Liu et al., 2001; Yu et al., 2008; Kolmos et al., 2011; Jung et al., 2016; Legris et al., 2016; Nieto et al., 2022）。数学模型显示，phyB和ELF3对植物发育的关键方面（如幼苗建立和开花时间）有重要贡献（Seaton et al., 2015; Chew et al., 2022）。ELF3功能的破坏会导致早开花，但伴随有黄化表型（Seaton et al., 2015; Chew et al., 2022）。增加的phyB活性（通过过表达或使用恒定活性YHB等位基因）促进光形态发生（photomorphogenesis），我们预期YHB在光形态发生方面对elf3具有显性效应（Wagner et al., 1991; Su and Lagarias, 2007; Hajdu et al., 2015）。模型结果支持在缺乏ELF3的情况下，增强的phyB信号会限制胚轴生长，同时保持早开花表型（Supplemental Figure 1A–1C）。表达YHB的植物在恒定黑暗中维持强健的生物节律，但phyB信号如何整合到生物钟系统中仍不清楚（Jones et al., 2015; Huang et al., 2019）。我们探讨了两种替代假设，将恒定的phyB信号应用于FMv2的生物钟模块（Supplemental Figure 1D）。最初，我们研究了恒定的phyB信号是否通过促进光诱导基因表达和抑制COP1积累来发挥作用，但未能重建YHB介导的生物节律（Supplemental Figure 1E）。有趣的是，研究表明光受体的激活不足以促进转录积累（Balcerowicz et al., 2021）。去除光激活基因表达后，我们得到了“仅COP1”变体（Supplemental Figure 1D和1F），该变体在恒定黑暗中保持生物节律，但与实验数据不一致，未能预测YHB植物的早开花表型（Supplemental Figure 1D和1F）。这种模型与实验数据的不一致促使我们考察其他生物钟模型。F2014生物钟模型修订了FMv2模块，基于实验数据引入了更精细的转录抑制波（Fogelmark and Troein, 2014）。结果“FMv2+F2014”模型再现了YHB介导的生物节律幅度保持，但未能再现YHB线在恒定黑暗中观察到的生物节律周期延长（Figure 1; Huang et al., 2019; Jones et al., 2015）。YHB的影响在“全球”和“仅COP1”近似中均显现，但“仅COP1”变体与实验数据更为一致（Figure 1B–1D）。未来的模型迭代可通过整合光合信号的转录调控进一步改善预测（Queiroz et al., 2023）。我们还研究了ELF3的破坏如何影响恒定的phyB信号。FMv2和FMv2+F2014模型均预测elf3在生物节律方面对YHB具有显性效应（Figure 1和Supplemental Figure 1）(McWatters et al., 2000; Covington et al., 2001; Thines and Harmon, 2010; Huang et al., 2016a)。YHB和elf3等位基因的组合限制了基因表达的日周期模式我们接下来通过将YHB等位基因引入ELF3（早开花3）中，试图在植物中重现模型预测（Su and Lagarias, 2007; Hu et al., 2009; Nusinow et al., 2011）。这使我们能够评估YHBelf3幼苗的表型是否与模型预测一致，最终目标是最小化植物的表型可塑性和生物节律调控（Figure 2）。
在体内，无论是YHB的恒定表达（35S::YHB [elf3-1 phyb-9]）还是由内源PHYB启动子驱动的YHB表达（PHYB::YHB [elf3-2]; YHBelf3-2），均无法在恒定黑暗中维持CCA1驱动的生物发光节律，只有15%的YHBelf3-2线被评估为有节律（Figure 2A和2B及Supplemental Figure 2A和2B）（Jones et al., 2015; Huang et al., 2019）。RT-qPCR分析显示，与YHB相比，YHBelf3-2线的候选基因（包括CCA1、LHY、GIGANTEA和伪响应调节因子9 [PRR9]）的生物节律丧失（Figure 1C）。
有趣的是，这些候选生物节律转录本的错误调控分为两组：CCA1/LHY（其启动子仅被phyB结合；Supplemental Figure 3）（Jung et al., 2016; Ezer et al., 2017）和GI/PRR9（同时被phyB和ELF3结合；Supplemental Figure 3）（Jung et al., 2016; Ezer et al., 2017）。在elf3-2和YHBelf3-2幼苗中，各转录本的积累模式随时间一致（Figure 1C）。尽管FMv2+F2014模型与CCA1、LHY和GIGANTEA的实验转录积累一致，但该模型预测PRR9 mRNA在elf3和YHBelf3植物中会降至基础水平（Figure 1D），而实验数据则显示elf3-2和YHBelf3-2植物中PRR9积累升高且无节律（Figure 1D）。这些数据表明ELF3对维持生物节律是必要的，但也突显了现有数学模型在完全重建生物节律系统方面的局限性。
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ELF3和YHB信号通路相互作用，影响光形态建成和昼夜节律基因的表达
为了进一步探讨YHBelf3-2幼苗中基因表达的调控，我们使用RNA测序（RNA-seq）评估在黄昏转入恒定黑暗48小时后的转录本积累（Zeitgeber Time [ZT] 60），此时野生型幼苗似乎已失去生物节律，转录本丰度相对稳定（Figure 1C, 2A和Supplemental Figure 4）。尽管所有基因型中饥饿标记基因（如ATL8和KMD4）上调，但YHB幼苗在ZT60时仍保持生物节律，表明生物节律在phyB依赖性下被主动抑制（Jones et al., 2015; Huang et al., 2019）。我们首先确定了相对于野生型的elf3-2、YHB和YHBelf3-2基因型的对数倍变化（-log2FC）（Supplemental Figure 4；Supplemental Table 1）。如预期，与光刺激反应相关的基因本体（GO）术语在YHB和YHBelf3-2中显著富集（Supplemental Figure 5；Supplemental Table 2），而与生物节律相关的GO术语也显著富集（Supplemental Figure 5；Supplemental Table 2）。接下来，我们评估了每个基因型中错误调控的转录本是否在特定时间段内表达，结果显示显著错误积累的转录本并未局限于单一时间段，表明生物节律系统在这些基因型中并未“锁定”在特定相位（Figure 2C）。在恒定黑暗中，elf3-2植物积累了更高水平的GIGANTEA、PRR9和BROTHER OF LUX ARRHYTHMO，而CCA1、LHY和REVEILLE8的稳态水平降低（Supplemental Figure 4A）。在YHB中，相对于野生型，有10个核心生物钟基因显著错误积累（9个上调，1个下调；Supplemental Figure 4A和4C）。我们还使用RNA-seq数据集检查了与光刺激反应相关的基因的差异表达（Supplemental Figure 4E–4H）（GO:0009416）。在740个光刺激相关转录本中，elf3-2植物中仅有33个错误调控，其中6个下调，27个上调（Supplemental Table 1）。elf3-2和YHBelf3-2植物仅共享7个错误调控转录本，其中一个（HOMEOBOX-LEUCINE ZIPPER PROTEIN 4 [HB4]）已知通过phytochrome信号和ELF3参与遮阴规避（Supplemental Figure 4E–4H）（Sorin et al., 2009; Jiang et al., 2019）。与此相比，YHB植物中有113个转录本相对于野生型显著差异表达，其中83个上调，30个下调（Supplemental Figure 4G–4H；Supplemental Table 1）。这些转录本中有91个在YHB和YHBelf3-2植物中同样差异表达（Supplemental Figure 4G–4H）。我们进一步分析了YHB和elf3对转录本积累的相互作用，比较YHBelf3-2与YHB或elf3-2的差异表达（Supplemental Figure 4I–4M）。elf3-2与Col-0的差异表达与YHBelf3-2与YHB的表达水平之间几乎没有相关性，表明ELF3的缺失对转录本积累的影响在有无YHB的情况下不同（Supplemental Figure 4I；R < 0.35）。然而，当比较YHB与Col-0和YHBelf3-2与elf3-2的转录本时，观察到强相关性（Supplemental Figure 4J；R > 0.8），这种相关性在将数据分为生物节律调控和非调控转录本时仍然存在（Supplemental Figure 4J和4L）。这些数据表明，尽管phyB和ELF3对基因表达的影响相互关联，但恒定的phyB信号对光形态发生具有显性效应（Nieto et al., 2022）。相比之下，ELF3在调控核心生物节律转录本方面发挥了更强的作用（Supplemental Figure 4M和4N）。在缺失ELF3的情况下，YHB表达仍影响某些核心生物节律转录本的积累，但大多数差异表达的核心生物钟转录本在比较elf3-2与Col-0和YHBelf3-2与YHB时高度相关（Supplemental Figure 4M，R = 0.8）。同样，比较YHB与Col-0和YHBelf3-2与elf3-2时，许多核心生物节律转录本的错误表达也发生了变化（Supplemental Figure 4N）。这些数据与ELF3在生物节律系统中的重要作用一致（Covington et al., 2001; Thines and Harmon, 2010），同时突显了YHB在不依赖ELF3的情况下影响核心生物钟转录本积累的潜在位点。我们接下来研究了YHBelf3幼苗在光照下的表现。尽管模型预测elf3和YHBelf3在黎明和黄昏时基本上会失去生物节律（Figure 2D），但所有基因型均显示出对实验光信号的生物节律适应，并保留了对黎明的日常反应，表现为CCA1::LUC2生物发光的相位变化（Figure 2E和2F）。野生型和YHB幼苗的CCA1::LUC2生物发光在黎明前1-3小时开始增加，表明这些植物对黎明的生物节律预期（Figure 2E）。相比之下，elf3-2和YHBelf3-2植物缺乏这种黎明预期，CCA1::LUC2生物发光仅在光照施加后增加（Figure 2E），这表明尽管生物节律受到干扰，这些植物仍保留了光敏感性。由于elf3-2和YHBelf3-2植物对黎明的反应仍然存在，我们进一步研究了CCA1启动子在不同光强下的激活（Figure 2G和2H）。我们设计了一个伪正弦光照模式，光强在白天变化，上午光强达到峰值，随后逐渐减弱（Figure 2G）。实验数据显示，elf3-2能够适应伪正弦光照，而YHBelf3-2的适应能力较弱（Figure 2G和2H），这与其他光感应系统（包括光合作用的代谢信号）对CCA1调控的影响一致（Haydon et al., 2013; Jones, 2018, 2019; Wang et al., 2024）。接下来，我们评估了在恒定光照下YHBelf3幼苗的生物节律。模型预测野生型和YHB幼苗在恒定光照下会有相似的生物节律（Figure 2I）。实验结果表明，YHB幼苗在恒定白光下的生物节律与野生型无显著差异，但CCA1::LUC+活性的相位比模型预测的CCA1 mRNA晚约6小时（Figure 2I–2K）。这种相位延迟可能反映了荧光素酶翻译所需的时间，或表明F2014模型中的光输入需要进一步改进，以纳入光合作用信号或其他光受体的控制。尽管存在这些局限，模型仍能重现elf3-2和YHBelf3-2幼苗在转入恒定白光后24小时内生物节律的消失（Figure 2J–2K）。YHBelf3-2植物对光和温度信号的响应表现出降低的生长和开花可塑性
YHB和elf3等位基因的组合使生物节律系统与光形态发生解耦，尽管YHBelf3-2植物在光照周期中仍能保持日常基因表达模式（Figure 1和2）。我们研究了这些遗传操作如何影响不同光照条件下的发育特征和生命周期转变（Figure 3）。FMv2+F2014模型预测YHBelf3的下胚轴长度与光周期无关（Figure 3A）。观察到5天大的幼苗中，YHB驱动的生长表型在下胚轴中持续存在（Figure 3B和3D），YHBelf3-2幼苗在不同光照条件下均保持短下胚轴表型，与YHB幼苗无显著差异（Figure 3B–3D）。在长日照条件下，YHB和YHBelf3-2幼苗与野生型无明显区别（Figure 3D）。表型可塑性排名显示，elf3-2幼苗的下胚轴长度对光周期更敏感，而YHB和YHBelf3-2幼苗的响应较弱（Supplemental Table 4）。在成熟的拟南芥植物中（播种3周后；Figure 3E和3F），野生型植物的大小在22°C下显著依赖于光周期长度，随着光周期增加，莲座直径减小（Figure 3E和3F）。elf3-2幼苗的莲座直径在长日照下比野生型植物更大，可能与这些植物的光感知丧失有关（Figure 3E和3F）。YHB和YHBelf3-2幼苗的莲座在大小上无明显区别，且无论日长如何，均更紧凑和一致（Figure 3E和3F）。YHB和elf3-2基因型在短日照条件下均表现出早开花表型，因此我们预期YHBelf3-2植物也会表现出这一表型（Figure 3G和3H）。模型预测YHBelf3植物的光周期敏感性降低，与elf3相似（Figure 3G）。实验结果表明，YHB、elf3和YHBelf3-2植物在长日照或短日照条件下均早于野生型开花（Figure 3G和3H）。我们还比较了YHBelf3-2植物在不同温度条件下的表现（Figure 4）。与光驱动的生物节律适应不同（Figures 2E-F），在温度适应下，野生型植物的CCA1驱动生物发光在黎明后6小时达到峰值（Figure 4A和4B）。YHB幼苗的相位未受影响，但elf3-2和YHBelf3-2幼苗在恒定光照下无法适应温度信号（Figure 4A和4B），这表明光线信号对elf3和YHBelf3-2幼苗的CCA1表达节律至关重要。![]()
在不同温度下，elf3-2的下胚轴表现出比野生型更大的可塑性，而YHB和YHBelf3-2的下胚轴对温度的响应较弱（Figure 4C；Supplemental Table 4）。环境温度也影响莲座直径（Figure 4D和Supplemental Figure 6）。在中性日照条件下，野生型植物在12°C和27°C之间保持相对一致的直径，但在12°C时略有显著下降（Figure 4D和Supplemental Figure 6；Supplemental Table 4）。相比之下，elf3-2幼苗在较低温度下更敏感，12°C和17°C时莲座直径显著下降（Figure 4D；Supplemental Table 4）。YHB和YHBelf3-2植物对这些温度变化也有反应，但大小差异小于elf3-2植物（Figure 4D；Supplemental Table 4）。在中性日照条件下，所有基因型在12°C下开花时间延迟，但YHBelf3-2植物的开花时间早于YHB，这与其他发育表型相反（Figure 4E；Supplemental Table 4）。随着温度升高，野生型植物的开花时间加快（Figure 4E；Supplemental Table 4），而YHB、elf3-2和YHBelf3-2基因型在17°C到27°C之间保持稳定的开花时间（Figure 4E）。因此，YHB和YHBelf3-2植物保持一致且早期的开花表型，表现出在多种光照和温度条件下降低的表型可塑性。光和温度形态发生是植物优化生长和发育以应对环境条件的重要过程。我们的数据验证了数学模型，并表明YHB的表达对ELF3破坏的形态后果具有显性效应，尽管ELF3对维持生物节律至关重要（Figures 1–3）。YHBelf3-2植物因此保持与野生型相似的营养表型，但具有早开花表型，且无法预期日常环境变化（Figure 3和4）。YHB和elf3等位基因的组合使植物对环境信号的响应降低，同时保持营养生长和可预测的开花。这表明，工程化生物节律系统与环境信号通路结合，可以创造出生长更均匀、环境响应更一致的植物。尽管表型可塑性在自然条件下具有优势（资源竞争和环境压力因季节和地点而异），但在现代作物单一栽培中，这一特性则可能带来不利影响。减少表型可塑性和生物节律调控对农业具有潜在的益处，现代育种计划的一个目标是提高作物的一致性，以便收获时间更可预测，质量更稳定。这适用于集约化、精准的户外农业和完全控制的环境农业（或垂直农业）。此外，气候变化迅速改变了全球的日长和温度关系，维持作物生产力或迁移到更适宜的温带地区将需要操控环境响应。我们的模型预测操控phyB和ELF3信号通路将限制对变化光周期的表型可塑性和生物节律调控（Figures 1–3）。关键是，我们已经证明，结合这两个等位基因（YHBelf3）可以限制表型可塑性和生物节律调控，同时保持早期开花时间和营养生长（Figures 3和4）。由于ELF3和YHB在不同物种中具有保守功能，因此将这些遗传改造应用于减少作物发育变异将非常有趣（Huang et al., 2017；Hu et al., 2020）。Battle MW, Ewing SF, Dickson C, Obaje J, Edgeworth KN, Bindbeutel R, et al. Manipulation of photosensory and circadian signaling restricts phenotypic plasticity in response to changing environmental conditions in Arabidopsis. Molecular Plant. 2024;17:1458–71.
