竹子，作为禾本科（Gramineae）的一员，因其生态和经济重要性而备受关注（参考文献[1]）。作为世界上生长最快的植物，竹子每天可生长达四英尺，最高可达100英尺。其快速生长和独特的机械特性使其成为植物发育研究的理想对象（参考文献[2–4]）。尽管竹子的意义重大，但其快速生长背后的分子机制仍不够清楚。
毛竹（Phyllostachys edulis）的基因组测序数据为研究这些机制提供了宝贵资源（参考文献[5,6]）。生长素（BR）是一类植物激素，在植物生长和发育中起着关键作用（参考文献[2,7,8]）。在竹子中，BR水平在竹笋发育过程中动态变化（参考文献[9]），这表明它们参与了这一过程。与其他激素不同，BR在局部发挥作用，而非全身性作用（参考文献[10–12]），因此需要进行特定部位的评估以了解其调控影响。以往研究已识别出参与毛竹BR生物合成和信号传导途径的基因，特别是在节间伸长方面（参考文献[13,14]），但具体的分子机制仍不明朗。
BRASSINAZOLE RESISTANT1（BZR1）是BR信号通路中的关键转录因子，调控与BR生物合成和生长过程相关的基因的抑制（参考文献[15,16]）。BZR1在细胞核中积累并结合BR响应元件（BRREs）以调节基因表达（参考文献[17,18]）。尽管在其他植物中已明确其作用，但在竹子快速生长期BZR1的作用仍不清楚。
本研究考察了竹笋的形态和生化特征，并将生长速率与BR含量相关联。通过生物信息学分析，识别出毛竹中八个BZR1转录因子基因（PeBZR1–1至PeBZR1–8），其中PeBZR1–7与BR含量呈正相关。进一步研究发现，PeBZR1–7与甾体22-α羟化酶（PeDWF4）相互作用，后者是BR生物合成的限速酶（参考文献[17,18]）。
此外，PeBZR1–4和PeBZR1–5通过结合BRRE抑制PeDWF4的表达。通过基因编辑技术，降低了竹叶中PeDWF4的表达，导致表皮细胞变短及细胞伸长相关基因表达减少。相反，过表达PeDWF4的拟南芥表现出更大的叶片和增强的细胞伸长相关基因表达。
本文的主要目的是阐明特定BZR1同种型在调控竹笋生长期间BR生物合成和反应中的作用。通过识别PeBZR1–4、PeBZR1–5和PeBZR1–7作为通过抑制PeDWF4而负调控细胞伸长的因子，研究结果为理解竹子的快速生长和BR调控的分子机制提供了新见解。这项研究不仅推进了对植物发育生物学的理解，还为农业应用提供了潜在的可能性。
BZR1是生长素（BR）信号通路下游的核心调控因子，参与植物生长过程，通过激活多个基因和抑制BR合成基因来调控生长反馈环（参考文献[15,16,28]）。在毛竹基因组中，鉴定出八个BZR1基因家族成员，命名为PeBZR1–1（PH02Gene17901）、PeBZR1–2（PH02Gene13331）、PeBZR1–3（PH02Gene50015）、PeBZR1–4（PH02Gene48563）、PeBZR1–5（PH02Gene42049）、PeBZR1–6（PH02Gene20679）、PeBZR1–7（PH02Gene31946）和PeBZR1–8（PH02Gene32452）。
对不同发育阶段（不同竹笋高度）的表达模式分析显示，PeBZR1–1在各高度上表达一致，而PeBZR1–2、PeBZR1–3和PeBZR1–5在100 cm、200 cm和400 cm高度时表达较高。PeBZR1–4在100 cm和200 cm高度表达较高，PeBZR1–6和PeBZR1–7则随着竹笋发育呈下降趋势。研究表明，高水平的BR有效激活BR信号通路，导致BZR1的积累（参考文献[17,18]），并且PeBZR1–7的表达与竹笋中的BR含量呈正相关。因此，假设PeBZR1–7可能参与竹笋快速生长的细胞伸长阶段。
本文进一步克隆了PeBZR1–7的全长编码序列，并通过酵母单杂交法鉴定了其靶向的片段，该片段对应于一种细胞色素P450类固醇22-α-羟化酶基因的启动子片段（PLAZA数据库中的Accession Number: PH01001012G0570或PH02V02Gene22853），全基因组序列长度为6149 bp，完整CDS序列为1503 bp，包含7个内含子和8个外显子（图2B）。由于八个PeBZR1之间序列相似性较高，进行了酵母单杂交实验以验证其他七个PeBZR1是否也与PeDWF4具有调控关系。孤立的PeDWF4启动子（2000 bp）用于酵母单杂交实验，结果显示PeBZR1–4、PeBZR1–5和PeBZR1–7能够特异性结合PeDWF4启动子，而其他四个PeBZR1成员未能与PeDWF4基因的上游启动子相互作用（图2C）。
为进一步验证PeBZR1转录因子与PeDWF4之间的转录调控关系，将PeBZR1–4、PeBZR1–5和PeBZR1–7转录因子基因与PeDWF4启动子分别克隆入双荧光素酶报告基因表达载体，并转化至农杆菌GV3101-pSoup中，通过注射法浸润烟草叶片。经过24–36小时共培养后，测量化学发光。双荧光素酶测定结果表明，当PeBZR1–4、PeBZR1–5和PeBZR1–7与PeDWF4启动子共同转化时，LUC荧光相对值下降（图S1），提示PeBZR1转录因子与PeDWF4存在抑制关系。
进一步的序列分析发现PeDWF4启动子中存在BR响应元件（BRRE）“CGTG(T/C)G”基序，位于ATG起始密码子上游1755 bp处（图2B）。为验证PeBZR1–4、PeBZR1–5和PeBZR1–7转录因子是否通过结合BRRE基序抑制PeDWF4基因表达，人工突变了BRRE基序（将CGTGTG变为CGACTG），结果显示突变后LUC荧光相对值的下降不再出现（图2D，S1），表明PeBZR1–4、PeBZR1–5和PeBZR1–7转录因子失去了结合和抑制PeDWF4表达的能力。这确认了PeBZR1–4、PeBZR1–5和PeBZR1–7转录因子能够通过结合其启动子中的BRRE基序抑制PeDWF4基因表达。
以往关于竹类快速生长特征的研究主要集中在节间伸长水平（参考文献[3,7,20,29]）。然而，细胞增殖和伸长是竹类节间长度的基本因素。研究表明，毛竹的细胞增殖率约为0.06个细胞每小时，远低于单子叶植物燕麦（Avena sativa）的0.29个细胞每小时（参考文献[30]）。毛竹的节间细胞长度显著长于其他植物，且随着竹笋高度的增加，节间细胞的长度也在增长。第15节间是毛竹中最长的部分，位于竹笋的中部，代表了毛竹的整体发育状态（参考文献[8]）。
观察显示，在5 cm高度的竹笋中，长短细胞长度均小于2.24 μm，而在800 cm高度的竹笋中，长细胞长度可达70–80 μm（图3A）。细胞长度在节间内也存在差异，顶部细胞最长，中部细胞长度适中，底部细胞最短。随着竹笋高度达到400 cm，顶部长细胞最早达到最大长度并停止伸长（图3A, B, S2），而中部和底部细胞仍在伸长。在快速生长期，竹笋中长薄壁细胞的长度可增加至35倍。在400 cm的竹笋中，顶部细胞已达到最大长度，中部细胞处于中期伸长阶段，底部细胞则处于早期伸长阶段（图3B）。因此，选择400 cm竹笋的第15节间进行详细研究，以代表不同的细胞伸长阶段。
在这三个部分中测量BR（生长素）含量，发现CS、TE和TY在细胞伸长的早期和中期阶段水平较低，而在晚期阶段达到峰值（图3C）。通过qPCR分析PeDWF4、PeBZR1–4、PeBZR1–5和PeBZR1–7的表达水平（图3C），发现PeDWF4在前两个阶段表达较高，而在晚期则下降；相反，PeBZR1–4、PeBZR1–5和PeBZR1–7在晚期的表达较高，前两个阶段则较低。这表明PeBZR1–4、PeBZR1–5和PeBZR1–7可能负调控PeDWF4的表达，暗示PeDWF4可能参与竹类细胞伸长。
为验证这一假设，本文在毛竹叶片中对PeDWF4基因进行了植物体内基因编辑，靶向PeDWF4的第一个外显子，构建了包含gRNA的转化载体（图4A, B）。通过基因组DNA消化分析确认成功编辑PeDWF4位点（图4C, D）。显微镜检查显示，编辑后的PeDWF4叶片表皮细胞长度较对照组缩短（图4E, F），细胞长度分析结果表明，未编辑细胞长度范围为200 nm至900 nm，编辑后范围为200 nm至700 nm，且以300 nm至600 nm为峰值（图4F），表明编辑后细胞长度显著减少。此外，qRT-PCR分析表明，细胞伸长相关基因的表达水平在PeDWF4编辑后显著降低（图4G）。
此外，BR合成相关基因的表达水平也被分析，结果显示BR增强表达1（BEE1）在PeDWF4编辑后显著降低（图4F），进一步表明PeDWF4在BR生物合成调控中发挥关键作用。为深入探讨PeDWF4在细胞伸长中的作用，本文在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中过表达PeDWF4，获得了超过70株转基因植物，并选择了两条进行详细研究（图5A）。结果显示，这些转基因植物的高度和叶片大小均大于对照组（图5B, C），与已知的Populus euphratica DWF4在拟南芥中过表达的表型一致（参考文献[37]）。为确定这些变化是由于细胞分裂还是伸长，选择了多个已知调控细胞伸长及BR生物合成的基因进行表达分析（图5D），结果显示转基因植物中这些基因的表达水平显著高于对照组。转基因植物的叶片栅栏组织细胞明显增大（图5E, F），且纵向切片显示转基因植物的茎组织细胞长度明显延长（图5G, H），表明过表达PeDWF4确实能够增加细胞长度和大小。
此外，创建了过表达PeBZR1–7的转基因株系（图S3A），观察到这些植物表现出矮小和生育力降低的表型。PeBZR1–7与PeDWF4的共同过表达未能逆转矮小表型。基因表达分析（图S3B）显示，PeBZR1–7的过表达不仅抑制PeDWF4，还抑制了拟南芥的内源AtDWF4基因，进一步导致难以逆转的矮小表型。研究表明PeDWF4在促进细胞伸长方面发挥了重要作用，转基因植物中PeDWF4的过表达显著增强了生长和细胞大小。此外，PeBZR1–7与PeDWF4之间的相互作用进一步强调了竹类快速生长的复杂调控机制。
Wang, S.; Lou, Y.; Qi, H.; Li, H.; Di, X.; Sun, H.; Gao, Z. BZR1 Targets Steroid 22-Alpha Hydroxylase 4 to Negatively Regulates Cell Elongation in Bamboo. International Journal of Biological Macromolecules, 2025, 289, 138832, doi:10.1016/j.ijbiomac.2024. 138832.
