在Cs1果实中，约33%的总胞嘧啶被甲基化，全基因组甲基化水平约为13%，低于番茄果实的22%。CG、CHG和CHH甲基化水平分别为41%、23%和8%。DNA甲基化的分布分析显示，甲基化在异染色质中富集（SI附录，图S1），转座元件（TE）主要位于着丝粒周围区域，并在CG及非CG序列上下文中表现出甲基化富集（SI附录，图S1 A和B）。相比之下，基因主要位于染色体臂，表现出CG甲基化的富集和非CG甲基化的耗竭（SI附录，图S1 A和C）。
研究发现，在甜橙果实中，CG上下文中，CGA和CGT基序的密度高于CGC和CGG，但各个染色体上的甲基化水平相当；在CHG上下文中，CCG基序的密度和甲基化水平明显低于CAG和CTG，符合拟南芥及其他植物的观察（24）；在CHH基序中，CTA和CCC的密度最高和最低，而CCH（CCC、CCA和CCT）中的胞嘧啶甲基化水平低于CTH和CAH（H = A、T或C）（SI附录，图S2）。
通过比较Cs1和Cs5的DNA甲基化组，发现总共识别出120万个差异甲基化胞嘧啶（DMC），其中88%为高甲基化（hyperDMCs），93%的hyper-DMCs出现在CHH上下文中，表明从Cs1到Cs5，CHH DNA甲基化主要增加（图1D）。从Cs1到Cs5的DNA甲基化增加可能源于总mC数量的增加或现有mC甲基化水平的提高。结果表明，Cs1到Cs5的mC数量增加，尤其在Cs1到Cs2期间增加显著（SI附录，图S3B）。
进一步使用Fisher精确检验的方法识别了不同甲基化区域（DMRs），发现Cs2（5,169）、Cs3（16,086）、Cs4（29,196）和Cs5（31,092）相对于Cs1的高甲基化区域数量逐渐增加（图1E），表明从Cs1到Cs5的DNA甲基化整体增加。分析显示，CHH在Cs1到Cs5期间显著高甲基化。进一步检查CG、CHG和CHH上下文的甲基化水平，发现Cs5的高甲基化区域主要出现在CHH和CHG上下文中，而CG甲基化水平没有显著变化，表明甜橙果实成熟过程中CHH高甲基化并未伴随CG去甲基化（图2A）。
在Cs5的低甲基化区域中，所有三个上下文均出现去甲基化，且CG去甲基化未伴随CHH高甲基化（SI附录，图S4A）。两个生物重复（A和B）在每个阶段的甲基化水平一致（图2A和SI附录，图S4A）。为每个DMR（Cs5 vs. Cs1）计算了稳健指数，稳健指数值较低的基因组区域在差异甲基化方面更具可信度。对10%高和低的hyper-DMRs进行排名，结果显示在两个重复中，DMRs的甲基化水平都从Cs1到Cs5增加（SI附录，图S4B）。显示的高甲基化和低甲基化DMRs的甲基化水平变化一致，主要在CHH上下文中表现为高甲基化，而低甲基化则在所有三个上下文中发生。
对DMR的组成和分布进行分析发现，高甲基化区域主要位于基因启动子（P < 1.0e-5，Fisher精确检验）（SI附录，图S5A），特别富集于基因的5′和3′侧翼区域，但在基因体区域耗竭；相反，低甲基化区域在基因中相对均匀分布。高甲基化区域也主要位于TE中（P < 1.0e-5，Fisher精确检验），尤其是短于2 kb的TE（SI附录，图S5），而低甲基化区域在TE中则耗竭。
综上所述，数据支持在甜橙果实发育和成熟过程中DNA甲基化整体增加，这与番茄果实成熟过程中的DNA甲基化全基因组减少形成鲜明对比。本文观察到DNA甲基化在Cs1到Cs5的每个阶段逐渐增加，这与番茄中在破裂阶段后CG和CHG上下文中甲基化显著丧失的变化不同。虽然在番茄中，CHH高甲基化发生在CG和CHG去甲基化期间，但在甜橙中CHH高甲基化并未伴随CG和CHG去甲基化。
在去甲基酶方面，识别了四个AtROS1同源基因，包括CsDME、CsDML1、CsDML4和CsDML3（SI附录，图S6B）。这四个基因在果实中的表达在成熟过程中显著降低（图3B和SI附录，图S6E），其中CsDML4的转录丰度最低（FPKM < 3）。去甲基酶基因表达的逐渐降低与Cs1到Cs5的DNA甲基化水平逐渐增加相一致。综合考虑DNA甲基转移酶和去甲基酶基因的表达模式，甜橙果实成熟期间DNA甲基化水平的增加最可能是由于去甲基酶基因表达的降低。
此外，研究发现成熟诱导的高甲基化区域（hyper-DMRs）在甜橙果实中与24-nt小干扰RNA（siRNAs）显著富集，表明去甲基酶与RNA介导的DNA甲基化（RdDM）之间存在对抗作用（SI附录，图S6F）。这些结果支持了在甜橙果实成熟过程中，去甲基酶的表达降低可能导致DNA高甲基化的增加。
研究聚焦于与高甲基化区域（hyper-DMRs）相关的基因，发现Cs5相较于Cs1有31,092个hyper-DMRs，其中8,985个位于基因启动子区域，可能参与成熟过程中的基因调控。共识别出7,007个与hyper-DMRs相关的基因，其中5,182个在至少一个样本中表达（FPKM > 1）。在这5,182个基因中，识别出1,113个下调DEGs（簇1）、950个上调DEGs（簇2）和3,119个非DEGs（簇3）（图4C和数据集S2）。簇1和簇2基因的表达在成熟过程中逐渐变化，而簇3基因的表达未显著变化，可能是由于其DNA甲基化变化较小。
对簇1、2和3基因的DNA甲基化变化进行分析，发现Cs5相较于Cs1的DNA甲基化增加主要发生在启动子区域，各簇基因的增加幅度相当（图4D）。与番茄成熟过程中表现出DNA甲基化变化但无表达变化的约5,000个基因类似，甜橙中的簇3基因也未因DNA甲基化变化而引起基因表达变化。对各阶段（Cs1至Cs5）三个簇基因的启动子（−2 kb区域）甲基化水平进行计算，结果显示簇1和簇2基因的DNA甲基化水平逐渐增加（SI附录，图S7B），且其转录水平也随之变化（图4C）。
对多个个别基因的DNA甲基化与基因表达的相关性进行分析，结果显示簇1基因的表达水平与DNA甲基化水平之间存在强负相关（R < −0.95）（图5A和SI附录，图S7C），与DNA甲基化在转录沉默中的典型作用一致；而簇2基因的表达水平与DNA甲基化水平之间则存在强正相关（R > 0.95）（图5B和SI附录，图S7D）。计算所有三个簇基因的相关系数，结果显示簇1基因的相关性峰值接近−0.9，表明大多数簇1基因存在强负相关；而簇2基因的相关性峰值接近0.8，表明大多数簇2基因存在强正相关。
尽管DNA甲基化通常被认为导致转录抑制，但近期研究表明，在番茄果实成熟过程中，DNA高甲基化与数百个基因的激活相关。本研究结果表明，DNA甲基化在甜橙果实的基因调控中也可能发挥积极作用。
随着果实成熟，光合作用相关基因的表达下降，研究显示成熟诱导的高甲基化与五个光捕获基因和四个光系统I电子传输基因的抑制相关（SI附录，图S8A和数据集S1）。对于簇2（上调的DEGs），分析发现与脱落酸（ABA）反应、类固醇代谢过程和芳香化合物代谢相关的基因富集。甜橙作为非气候性果实，其成熟过程中ABA起着重要作用。本研究发现51个与高甲基化区域相关的基因属于“响应ABA”类别，21个基因属于“ABA激活信号通路”类别（SI附录，图S8B），表明DNA高甲基化可能通过调控不同发育阶段的重要基因，促进甜橙果实的成熟。
为验证DNA甲基化对甜橙发育和成熟的重要性，本文使用DNA甲基化抑制剂5-氮胞苷对未成熟甜橙果实进行处理。
结果显示，抑制剂注射阻止了甜橙的脱绿（图6A），这是甜橙成熟的重要指标。通过甲基化敏感的McrBC-qPCR检测，发现5-氮胞苷处理后DNA甲基化水平下降（图6B），与全基因组亚硫酸盐测序结果一致。对簇1基因（Cs3g20300）和簇2基因（Cs4g09560）的转录水平分析显示，5-氮胞苷处理增加了Cs3g20300的表达，而降低了Cs4g09560的表达（图6C）。这些结果（图6C和SI附录，图S9）支持DNA高甲基化在柑橘果实成熟及相关基因表达调控中的重要作用。
研究发现，甜橙果实成熟期间，DNA去甲基化酶基因的转录下调，而DNA甲基转移酶基因相对较少且未上调，表明DNA甲基化的增加可能由去甲基化酶表达减少引起。此外，成熟诱导的高甲基化区域（hyper-DMRs）显著富集24-nt小RNA，提示这些区域的去甲基化酶与RdDM（RNA依赖性DNA甲基化）途径相互作用。随着果实成熟，RdDM的关键成分（如CsDRMs、CsNRPE1和CsAGO4）也呈下调趋势。
在甜橙果实成熟过程中，除了全基因组高甲基化外，还有1,089个基因组区域发生低甲基化（hypo-DMRs）。这些甲基化变化并非随机，表明在成熟过程中，DNA甲基化和去甲基化的基因表达变化共同生成了高低甲基化模式。成熟诱导的高甲基化与数百个不再需要（no longer needed）的基因（如细胞壁组织和光合作用相关基因）的抑制相关，但也与一些重要的甜橙成熟的基因（如ABA响应和信号通路基因）的活跃表达相关（图4和SI附录，图S8A/B）。
5-氮胞苷处理结果支持了DNA高甲基化在甜橙果实成熟中的重要性，提示DNA甲基化不仅在基因表达抑制中发挥作用，也可能在某些基因的激活中起关键作用。DNA甲基化和基因表达变化的分子机制需要进一步研究。
材料与方法
植物材料
甜橙从中国浙江省松阳县的一家商业果园获得。在五个不同的发育阶段（90、120、150、180和210 DAB）收集了水果。橙子果皮类似于番茄果实内层的组织，该组织是由花卉的子房壁发育而来的，收集后立即在液氮中冷冻，并在−80 °C条件下保存，直到进行DNA和RNA提取。为了进行DNA甲基化抑制剂处理，选择了在破裂阶段前2周的水果。对于该处理，将1 mL的50 mM 5-azacytidine（Sigma）溶解于水后射到果皮中。注射每周重复四次。阴性对照（空白）水果注射了1 mL的去离子水（ddH2O）。
McrBC-qPCR 分析
从对照样品和5-azacytidine处理样品中提取了基因组DNA。对于5-氮胞苷处理样品，使用了绿色果皮进行DNA提取。1微克的基因组DNA在过夜中与McrBC（新英格兰生物实验室）消化，并使用20 ng DNA作为模板进行qPCR；消化的阴性对照是在没有GTP的情况下进行的，作为标准。
McrBC是一种检测基因组小部分区段的DNA甲基化情况的核酸内切酶。只能降解甲基化的区域，对未甲基化区域不起作用。
全基因组亚硫酸盐测序与分析
从果实中使用DNeasy Plant Maxi Kit（Qiagen）提取了基因组DNA，然后用于构建文库，采用了Illumina的标准DNA甲基化分析协议和新英格兰生物实验室的Ultra II DNA文库准备试剂盒。样本在中国科学院上海植物逆境生物学中心的基因组核心设施使用Illumina HiSeq2500进行测序。质量控制、比对和差异甲化分析详见补充信息的SI附录。
RNA分析
使用TRIzol试剂（Ambion）从橙子果皮中提取总RNA。对于反转录，使用1 μg的RNA和oligo dT引物在20 μL反应体系中使用qScript cDNA SuperMix试剂盒（Quanta）合成cDNA。对于RNA-seq，文库的构建和测序是在中国科学院植物逆境生物学上海中心的基因组核心设施进行的，使用Illumina HiSeq2500进行测序。质量控制、比对和差异甲基化分析的详细信息见附录SI，补充信息文本。
数据下载：
这篇文献我个人感觉是一篇很经典的dna甲基化和转录组联合分析的文章，数据也提供了。感兴趣的同学可以下载下来练习一下。
The sequencing data generated in this study have been deposited in National Center for Biotechnology Information’s Gene Expression Omnibus and are accessible through the GEO Series accession nos. GSE108930 (31), GSE108931 (32), and GSE120025 (33).
