人类胚胎的早期阶段，原始生殖细胞（PGCs）于大约第12至16天在羊膜或胚胎的后部外胚层形成，并开始发育。这些细胞通过胚胎的卵黄囊和内胚层迁移到生殖脊，并在这一过程中启动了一系列表观遗传重编程，这一重编程通过全基因组的DNA去甲基化和组蛋白修饰重置了遗传记忆。完成这一重编程过程后，PGCs最终分化为前精原细胞或卵原细胞。利用多能干细胞进行体外生殖细胞生成为研究生殖细胞的发展机制提供了新途径。但是现有的体外生殖腺系统在细胞分化效率和实验控制上存在局限性。
2024年5月20日，京都大学iPS細胞研究所Mitinori Saitou团队在Nature上发表了题为“ In vitro reconstitution of epigenetic reprogramming in the human germ line ” 的研究论文。本研究通过诱导了人类多能干细胞衍生的原始生殖细胞样细胞（hPGCLCs）进行表观遗传重编程，并分化为前精原细胞或卵原细胞，实现了细胞的大规模扩增。通过操控骨形态发生蛋白（BMP）信号通路及调节MAPK（ERK）途径和DNA甲基转移酶活性，推动了与复制相关的DNA被动去甲基化过程。这项工作不仅在技术上取得了重大进展，也为未来人类体外生殖细胞的研究和生殖医学的应用提供了重要的生物学框架和理论基础。
文章信息与样本技术方法
结果展示
（1）BMP信号传导促进hPGCLC分化
a. 人类生殖细胞发育示意图。显示了分化阶段、关键标志物以及本研究涵盖的阶段（黄色）。
b. 全文使用的缩写汇总。
c. 在指示的培养天数内，通过BMP驱动的M1-AGDT或F1-AGVT hPGCLC分化过程中AG和DT或VT的流式细胞术分析。
d. 从指示的人类iPS细胞系诱导的hPGCLC衍生细胞的生长曲线（左）和倍增时间（右）。
e. 在指示的培养天数内，通过BMP驱动的M1-AGDT或F1-AGVT hPGCLC分化过程中具有指示报告基因表达的细胞比例。
f. c72阶段M1-AGDT hPGCLC衍生细胞的浮雕对比和荧光（DT和AG）图像。g. 在指示的培养天数内M1-AGDT和F1-AGVT hPGCLC衍生细胞的核型（左；具有46或其他染色体数量的细胞百分比；右：染色体展开图）（每个时间点一个生物学重复）。
a. 热图显示了指定细胞类型中所示基因的表达水平。
b. 在hPGCLC诱导及BMP驱动或基于xrOvary的hPGCLC分化过程中的转录组主成分分析（PCA）。
c．采用均匀流形近似和投影（UMAP）和Louvain聚类方法分析7至16周内（w.p.f.）体内女性生殖细胞和体外F1-AGVT hPGCLC衍生细胞在c11、c56、c86和c117日的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据。显示细胞类型（左）和细胞周期（右）标注。
d-f, UMAP图如c所示，标注了体内和体外样本（d），通过RNA速度分析的体内外细胞类型潜在发展轨迹（e），以及所示基因的表达水平（f）。
(3) BMP驱动的hPGCLC分化过程中的DNA甲基化组重编程。
WGBS分析BMP驱动的hPGCLC分化过程，揭示人类iPS细胞的全基因组5mC水平显著降低，从85%降至约10%。此外，DNA去甲基化作用广泛，不仅包括性腺生殖细胞中表达上调的13个基因的启动子，还涉及到“减数分裂细胞周期”的基因和印记基因的差异甲基化区域（DMRs），几乎所有的遗传印记都被清除。BMP信号传导通过调节DNA甲基化水平，有效促进了hPGCLC的表观遗传重编程和分化。
a.展示了在不同细胞类型中指定基因座上的平均5mC水平。
b.显示了在指定样本中印迹DMR的5mC水平。
c.展示了M1-AGDT c122细胞和M1-AGVT c82细胞间共有或特有的逃逸基因数量，中间图展示了M1-AGDT c122和M1-AGVT c82细胞、M2 c76细胞与9周龄体内男性生殖细胞共有或特有的逃逸基因数量，底部图展示了F1-AGVT c127细胞、F2-AGVT c68细胞、ag120细胞与9周龄体内女性生殖细胞共有或特有的逃逸基因数量。
d. 显示了指定样本中DNA去甲基化逃逸者的关系以及指定样本中逃逸者的组成。
(4) TET1保护hPGCLC避免分化成胚外细胞
a.主成分分析显示了BMP驱动的野生型（WT）细胞和TET1基因敲除（T1KO）hPGCLC分化的转录组。
b.UMAP和Louvain聚类分析显示了在c18时野生型和TET1 KO hPGCLC培养的单细胞RNA测序数据（左列上方）.
a.小提琴图展示了野生型和TET1 KO hPGCLC来源细胞在c12和c42时期的平均5mC水平。
b.散点图显示c12时期野生型和TET1 KO hPGCLC来源细胞的5mC水平分布。
c.展示野生型细胞与TET1 KO细胞5mC水平差异的富集优势比和q值。
d-g.小提琴图和散点图对比野生型与TET1 KO来源的hPGCLC细胞在c12时期的5mC和表达水平差异。
h.描述TET1 KO来源的hPGCLC细胞在特定启动子类型和ER基因中上调或下调基因的富集优势比。
i.描述人类ES细胞中由TET结合的c12上调基因在启动子类别中的优势比。
总结
该研究揭示了BMP信号在维持生殖细胞命运中的重要作用，还指出了TET蛋白在去甲基化和转录抑制中的功能，特别是在控制双价基因表达中的作用。BMP信号通过阻断这些细胞的分化，类似于其在维持小鼠胚胎干细胞自我更新中的作用。研究还发现在BMP驱动的hPGCLC分化过程中，除了常染色体和活动的X染色体（Xa）外，非活动的X染色体（Xi）显示出对重编程的抵抗，这可能由于人类iPS细胞中的异常Xi表观遗传状态所致。为进一步理解人类原始生殖细胞的表观遗传重编程提供了新的视角，并为未来的生殖医学研究及治疗策略开发奠定了基础。
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