今天介绍的这篇文章是近日南京农业大学张绍铃院士团队在Genome Biology （ IF=18.1）杂志发表题为“ Multi-omics provide insights into the regulation of DNA methylation in pear fruit metabolism” 的研究论文，该研究对梨果肉从果实发育到成熟的11个发育阶段的转录组、小RNA、代谢组、蛋白质组和DNA甲基化和进行了全面分析，揭示了DNA甲基化在梨果肉代谢物生产中的调节作用。
![]()
果实发育是高等植物生命周期中的一个独特过程，有助于代谢物的产生，为人类提供富含促进健康的化合物的饮食。随着代谢物的积累，一系列生理变化伴随着水果的扩张和成熟。在各种肉质水果中，糖、有机酸、类黄酮、脂肪酸、多酚、萜类和植物激素等代谢产物均得到了广泛研究。虽然注释代谢物的生物合成途径在不同物种之间是相似的，但代谢物的时空分布和自然变化在不同物种之间，甚至同一物种内的不同品种之间差异很大。
转录活性受染色质压实的影响，染色质压实受DNA甲基化和组蛋白翻译后修饰（PTMH）的调节。与PTMH相比，DNA甲基化在肉质水果中得到了更广泛的研究，因为它参与了花青素的积累，风味生物合成，以及水果发育和成熟。植物DNA甲基化发生在两个对称的上下文中，CG和CHG，以及一个不对称的上下文，CHH（H代表A、T或C）。虽然在拟南芥和一些肉质水果中已经明确阐明了DNA甲基化和去甲基化的机制，但对果实发育过程中DNA甲基化的调节机制仍然知之甚少。中文标题：多组学研究为梨果实代谢中DNA甲基化的调控提供了新的思路发表期刊： Genome Biology （IF = 18.1/SCI一区）技术方案：RNA-seq、小RNA测序、蛋白组学、WGBS、LC–MS/MS等样本类型： 从果实发育到成熟的11个发育阶段的梨果肉；DNA甲基化抑制剂5 '-aza处理的梨果肉愈伤组织为了研究梨果肉发育过程中代谢产物的变化，研究人员分别在开花后4 (S1)、6 (S2)、8 (S3)、10 (S4)、12 (S5)、14 (S6)、16 (S7)、18 (S8)、20 (S9)、22 (S10)和24 (S11)周采集梨果实。代谢组测定鉴定出梨果肉中492种代谢物。在每个阶段检测到大约456种代谢物，其中371种代谢物普遍存在于所有阶段。通过比较每一对阶段之间的相对含量，共鉴定出449种差异积累代谢物(DAMs)。这些DAMs属于32个不同的类别，包括植物激素、花青素、氨基及其衍生物、碳水化合物、黄酮、黄酮醇、羟基肉桂酰衍生物、脂类、核苷酸及其衍生物和有机酸等，并根据其积累趋势划分成8个簇(I→VIII)。与后期相比，集群I、II和IV在早期果肉中显示出更高水平的代谢物，表明它们与早期果肉发育有关。集群VII和VIII分别在S7和S6表现出较高水平的果肉代谢物，表明这些代谢物可能与果实增大有关。与其他阶段相比，集群III、V和VI在S10和S11的果肉中显示出更高水平的代谢物，表明它们与果实成熟有关。![]()
![]()
为了建立基因活性与梨果肉代谢之间的关系，研究人员利用质谱法研究了梨果肉代谢各阶段的蛋白质组。在所有样品中共检测到5106个蛋白。在每个阶段检测到大约4074种蛋白质，其中2860种蛋白质在所有阶段一致存在。通过比较不同时期的蛋白质丰度，在果肉中共鉴定出3469个差异表达蛋白(DEPs)。蛋白质组学和代谢组学的综合分析显示，1038、1012、167、843、927、287、426和162个DEPs分别与I→VIII集群的代谢物呈正相关，而834、883、68、509、922、60、458和58个DEPs与同一集群的代谢物呈负相关。为了弥补质谱法检测到的蛋白质数量有限的缺陷，研究人员利用转录组测序来研究所有预测基因在梨果肉中的表达模式。每个阶段检测到约28,748个基因，其中24,806个基因在所有11个阶段均一致存在。通过比较每对阶段之间的表达水平，在果肉中共鉴定出22,055个差异表达基因(DEGs)。转录组和代谢组的综合分析显示，9524、7120、382、6257、2757、505、1818和433个基因分别与I ~ VIII群中的代谢物呈正相关，而2138、2564、80、1144、5372、202、4050和481个基因与同一群中的代谢物呈负相关。在去除转录和翻译水平上与代谢物相关性不一致的有争议的基因后，研究人员构建了一个全面的基因代谢物数据库。在该数据库中，220种代谢物可在京都基因与基因组百科全书(KEGG)数据库中检测到。为了进一步评估该数据库的有效性，作者使用先前报道的代谢途径进行了测试。例如花青素的成分牡丹苷-3-半乳糖苷与各种花青素生物合成基因正相关；蔗糖和葡萄糖与糖代谢相关基因呈正相关；ABA与生物合成基因呈正相关。这些结果表明，基因代谢物数据库准确地识别了先前报道的代谢途径中涉及的关键基因，从而为了解果肉的代谢调节网络提供了有价值的见解。为了研究各种代谢途径的潜在调控，作者构建了每个簇内不同类别代谢物的代谢调控网络。结果显示，4764个基因与至少两类代谢物相关，其中2390个基因至少涉及两个聚类。例如，在检测到的10个ABA生物合成基因中，有8个基因也与蔗糖和葡萄糖相关，这一结果与前人报道的ABA能提高可溶性糖含量的结果一致。![]()
图2 梨果肉代谢组、蛋白质组和转录组数据的综合分析为了研究果肉中DNA甲基化的动态，在每个阶段对果肉样本进行了全基因组亚硫酸盐测序（WGBS）。在果肉发育过程中，DNA甲基化水平在全基因组和CHH区逐渐升高，在CG区逐渐降低，在CHG区几乎没有变化。此外，转座因子(TE)两个侧翼区域的CG甲基化水平逐渐降低，而TE小体及其侧翼区域的CHH甲基化水平逐渐升高。这些结果表明，DNA甲基化的增加主要是由CHH甲基化的升高引起的。为了研究DNA甲基化对基因表达的影响，作者调查并发现DNA甲基化存在于38159个基因的启动子中，包括20322个DEGs。为了验证DNA甲基化对梨果肉基因表达的影响是正向/负项调控，研究人员用50 mM的DNA甲基化抑制剂5-氮杂胞苷(5 '-aza)处理梨果肉愈伤组织，结果显示5’- aza处理后胞嘧啶甲基化水平降低。随后，对5’- aza处理的愈伤组织和对照愈伤组织进行RNA-seq，鉴定出1426个DEGs。从1328个DEGs的启动子中共检测到58,943个差异甲基化区(DMRs)，其中包括基因代谢物数据库中存在的705个DEGs。表明这1328个基因的表达水平与梨果肉愈伤组织中DNA甲基化的变化有关。为了确定果实中DEG启动子内的甲基化区域，在不同阶段对胞嘧啶甲基化位点富集区域的甲基化水平进行了分析。在果肉35176个基因的启动子中共鉴定出178499个DMRs。在这些DMRs中，92912个位于18672个DEG的启动子内，包括与437个DAM相关的12,396个DEG。在12,396个DEG中，647个在5 ' - aza处理的愈伤组织和对照愈伤组织之间存在差异表达。在排除S1期与其他阶段无差异表达的基因后，作者发现在果实愈伤组织中被5’- aza处理抑制的基因中56.67 ~ 78.17%的基因在后期(从S3到S11)的发育果实中比S1表达更高。这些结果表明，这18672个DEGs的表达可能受到了果肉DNA甲基化的修饰。![]()
为了阐明梨果肉发育过程中DNA甲基化增加的潜在机制，研究人员鉴定了参与RdDM途径的基因（AGO、DCL和RDR），然而这些基因中大部分表达的减少与梨果肉发育过程中DNA甲基化的增加并不一致。作者进一步对11个阶段的果肉进行了小RNA测序，然而，4个DCL基因的表达不会导致果肉中24-nt siRNA的丰度增加。因此，在RdDM途径中观察到的基因表达变化与梨果肉发育过程中DNA甲基化的增加无关。为了研究DNA甲基转移酶与梨果肉发育过程中DNA甲基化增加之间的潜在关联，研究人员 12个拟南芥DNA甲基转移的同源基因。然而，这些基因的差异表达与梨果肉发育过程中DNA甲基化的增加也不一致，DNA甲基转移酶基因表达的变化也与梨果肉发育过程中DNA甲基化的增加无关。作者进一步从梨基因组中鉴定了DNA去甲基化酶ROS1基因的8个同源基因。在这些基因中PbDME1.4、PbDME1.5和PbROS1.3的表达水平在肉发育过程中逐渐下降，并与C和CHH甲基化水平呈负相关。此外，从S5到S11, PbROS1.1和PbROS1.2在果肉中的表达水平逐渐降低。这些结果表明，这五个基因的表达减少与梨果肉发育过程中DNA甲基化的增加是一致的。考虑到拟南芥IDM1在催化组蛋白H3K18乙酰化以促进ROS1表达的作用，作者从梨基因组中鉴定了拟南芥IDM1的三个同源基因。PbIDM1.1、PbIDM1.2和PbIDM1.3的表达水平在果肉发育过程中也逐渐下降，并与C和CHH甲基化水平呈负相关。因此，三个IDM基因表达的减少与肉发育过程中DNA甲基化的增加是一致的。综上所述，这些研究结果表明，梨果肉发育过程中DNA甲基化的增加可能与DNA去甲基化相关基因的表达减少有关。![]()
图4 去甲基化酶基因表达的减少与梨果肉发育过程中DNA甲基化的增加是一致的大多数DMR修饰的DEG与ABA、蔗糖和葡萄糖的合成和代谢过程相关，部分DEG启动子中/基因区的DNA甲基化，与ABA、蔗糖和葡萄糖相关。ABA是一种重要的植物激素，通过增加可溶性糖(包括蔗糖和葡萄糖)含量和乙烯释放来促进梨果实成熟。因此，DNA甲基化可能通过影响ABA生物合成参与梨果肉发育。为了验证这一假设，在S9处用果皮下的5′-aza处理梨果肉并进行WGBS测序,结果表明5’- aza处理导致DNA甲基化水平降低。与对照相比，5′-aza处理促进了果皮中叶绿素的积累，导致果皮变绿；还促进了果肉中ABA、β-胡萝卜素和叶黄素的生物合成。这些结果表明DNA甲基化参与了类胡萝卜素的代谢，并可能通过增加ABA的产生来加速果实的成熟。在DMR修饰的DEG中，表达水平上的10个通路基因和35个转录因子与ABA含量呈正相关。在这10个通路基因中，PbPSY、PbZDS1、PbHYB1、PbSDR2和PbAAO在梨果肉中从S5到S11的表达水平高于S1到S4。5′- aza处理后，果肉中PbPSY、PbHYB1和PbAAO的表达水平与对照相比有所上调，而PbZDS1和PbSDR2的表达水平无显著差异。这表明，DNA甲基化抑制PbPSY、PbHYB1和PbAAO的表达，从而限制了果肉中ABA的产生。在35个转录因子中，有18个在S5 ~ S11阶段的果肉中表达量相对较高。5′-aza处理后，果肉中PbZFP1、PbHB3、PbERF、PbB3.1、PbZFP4、PbbZIP1、PbGRAS3、PbbHLH3和PbNAC1的表达水平与对照相比上调，而PbZFP2、PbHB1、PbHB2、PbIAA2、PbIAA3、PbbHLH2和PbbHLH1的表达水平无显著差异。这些结果表明，DNA甲基化降低可能会促进几种转录因子的表达，从而诱导PbPSY、PbHYB1和PbAAO的表达。此外，与对照相比，5'-aza处理的果肉中PbIAA1和PbMYB1表达下调，表明DNA甲基化降低也可以抑制基因表达。![]()
(6) 一种调节ABA生物合成的新型转录因子的验证为了阐明所测试的转录因子在ABA生物合成中的潜在作用，研究人员利用ABA生物合成基因的启动子进行了双荧光素酶实验。根据表达和DNA甲基化分析，共选择了12个转录因子。结果显示，在PbPSY、PbZDS1、PbHYB1、PbSDR2和PbAAO启动子的控制下，LUC基因被测试的12个转录因子中的至少3个显著激活。AAO是催化脱落醛转化为ABA的关键酶。双荧光素酶实验显示，PbAAO启动子的活性可以被属于5个不同家族的9个转录因子增加。在这些家族中，有报道称ZFP、Homeobox、MYB和bHLH 转录因子参与果实成熟。为了测试这些家族中已鉴定的转录因子与PbAAO启动子之间的直接相互作用，作者进行了双荧光素酶实验、酵母单杂和电泳迁移率转移试验(EMSA)。结果都表明PbZFP1、phbhb1、phbhb2和phbhb3可以结合到PbAAO起始密码子的上游区域，即这些转录因子可以与PbAAO启动子物理相互作用以增强其活性。最后，研究人员还选择了具有核定位的PbZFP1进行ABA生物合成功能测试。过表达和病毒诱导基因沉默(VIGS)都表明，过表达PbZFP1的果肉中，PbZFP1、PbHYB1、PbSDR2和PbAAO的表达量以及ABA含量均高于对照的果肉，说明PbZFP1积极介导ABA在果肉中的生物合成。![]()
图5 PbZFP1正向调控果实中ABA的生物合成
综上所述，这项研究建立的基因代谢物数据库有助于探索代谢调控网络，为改善梨果实品质提供依据。梨果肉发育过程中DNA甲基化的增加抑制了其发育诱导的ABA积累，这是通过调节参与ABA生物合成分子网络的基因来完成的。这表明DNA甲基化参与果肉代谢，介导梨果肉发育过程，并可能延迟果实成熟。![]()
图7 全文机制概览
生物样本库队列研究的显著特征是样本数量巨大，从几百样本的小队列到上万样本的大队列。艾斯基因全面推出Acegen TBSeq Panel定制技术服务，携『中小样本高通量筛选 + 大样本中通量验证方案』，将大样本队列甲基化研究带进百元级别时代，助力临床转化应用。
![]()
欢迎扫码咨询技术，加入学术交流群
1、WGBS：高分SCI攻略｜全基因组甲基化测序—表观机制研究神器
2、RRBS: 强化版简化基因组甲基化测序 (Improved RRBS)——全基因组范围、最高性价比甲基化方案！
3、TBS: 王牌技术｜靶向甲基化测序TBS Panel
4、935k甲基化芯片：技术升级｜935K甲基化芯片测序——队列研究高性价比技术
5、ox5hmC: 氧化-亚硫酸盐测序(oxidative bisulfite sequencing)——羟甲基化 5hmC 单碱基分辨率方案！
6、5hmC: 羟甲基化 5hmC 化学捕获测序(5hmC Seal-seq)—超高灵敏度羟甲基化测序方案！
7、C100计划：技术干货｜大样本队列甲基化研究完整解决方案来啦
8、衰老时钟研究方案：衰老专题 | 解读表观遗传时钟的精准检测方法
参考文献: Gu C, Pei MS, Guo ZH, Wu L, Qi KJ, Wang XP, Liu H, Liu Z, Lang Z, Zhang S. Multi-omics provide insights into the regulation of DNA methylation in pear fruit metabolism. Genome Biol. 2024 Mar 14;25(1):70. doi: 10.1186/s13059-024-03200-2. PMID: 38486226; PMCID: PMC10938805.原文链接: https://doi: 10.1186/s13059-024-03200-2本文来源于艾斯基因，版权归原作者所有，授权转载请联系原作者。文章只为学术新闻信息的传播，不代表本公众号观点。如有侵权请联系删除。
