DNA羟甲基化看这篇就够了：检测方法及在液体活检中的应用 | 深度综述

图1 DNA羟甲基化在液体活检中的分析方法

DNA甲基化（5mC）是哺乳动物DNA中研究最深入的表观遗传标记，对基因调控至关重要，可以通过DNA甲基转移酶（DNMT）从S-腺苷甲硫氨酸（SAM）转移甲基基团到胞嘧啶的5位形成。而5hmC是通过TET（ten-eleven translocation）酶家族（如TET1、TET2和TET3）氧化5mC生成的，进一步的氧化反应可以产生5-甲酰胞嘧啶（5fC）和5-羧基胞嘧啶（5caC），但这些中间体的丰度远低于5hmC。且5fC和5caC不稳定，会被胸腺嘧啶DNA糖基化酶（TDG）和基础切除修复（BER）机制切除并修复，恢复为未修饰的胞嘧啶（C）。而与5mC、5fC和5caC相比，TET酶和TDG-BER偶联机制对5hmC的亲和力较低，表明5hmC是稳定的，并不总是容易发生去甲基化。

图2 DNA羟甲基化的生物学途径

5hmC与许多生物学过程有关，包括胚胎发育、干细胞多能性、T淋巴细胞耗竭和分化以及不同疾病的发病机制。重要的是，5hmC在活性基因调控中起着关键作用。5hmC富集于转录活性区域，如基因体、增强子和启动子边缘。富含5hmc的区域通常位于活性组蛋白修饰（如H3K4me2和H3K4me3）和增强子（如H3K4me1和H3K27ac）附近，表明其可能参与调节活性基因表达。许多研究表明5hmC水平与基因表达呈正相关。然而，在不同的羟甲基化区域和细胞类型，可能会观察到相反的结果。

图3 DNA羟甲基化的生物学功能

尽管5hmC整体水平较低，但5hmC在不同细胞类型、组织和疾病状态中的分布差异很大。一般来说，5hmC在脑组织（约占所有胞嘧啶的0.67%）和胚胎干细胞中最为普遍。有趣的是，5hmC水平似乎与细胞增殖呈负相关，特别是有丝分裂后细胞通常具有较高水平的5hmC。

cfDNA羟甲基化液体活检始于2017年，当时Song等人开发了一种高度敏感的化学标记分析方法，能够从少量cfDNA输入中检测低水平的5hmC。从那时起，它被广泛地应用于临床，包括早期癌症检测和预测癌症预后。尽管cfDNA中的5hmC水平通常低于组织，但先前的研究表明cfDNA中的5hmC模式和动态反映了组织中发生的变化。而且由于5hmC相对稳定，基因组DNA上的5hmC标记可以在cfDNA片段中被检测到，这表明它有可能成为一种微创癌症生物标志物。

各种类型的癌症中都可以检测到5hmC的整体水平降低，包括膀胱癌、脑癌、胰腺癌和乳腺癌。在某些情况下，5hmC水平的大幅降低与肿瘤侵袭性更强和预后更差相关。在皮肤T细胞淋巴瘤（CTCL）细胞系中，研究人员观察到5hmC随着肿瘤侵袭性的增加而逐渐丧失，其中大细胞转化的CTCL细胞系5hmC减少的比例最大，其次是未转化的CTCL，以及CTCL前斑块和斑块。同样，非小细胞肺癌（NSCLC）中cfDNA中5hmC的阶段依赖性缺失，与非转移性NSCLC和健康个体相比，转移性NSCLC显示出最低水平的正常化羟甲基化区域。基因座特异性5hmC在转录活性区域的增加在癌症中也有报道，5hmC在基因小体、开放染色质区域（DNase I超敏位点）和组蛋白修饰活跃区域（H3K27ac、H3K4me1、H3K9me1）的富集。这些研究表明，整体和个别基因的5hmC模式是可以区分癌症和非癌症样本的，展示了5hmC作为癌症生物标志物的潜力。

5hmC作为一种有前景的癌症生物标志物，显示出独特的整体和局部模式，可以区分癌变和非癌变样本。过往研究已经表明了5hmC作为癌症诊断、预后和预测生物标志物的潜力，强调了它在癌症管理中的强大效能，它还可以与其它组学数据集分析，如甲基组学、转录组学、片段组学和基因组学，以提供对肿瘤发生生物学基础的更全面的理解。

图4 DNA羟甲基化的在液体活检中的应用

• DNA羟甲基化作为癌症检测的生物标志物

早期发现癌症可以更有效地治疗和获得更好的结果，因此拥有稳定可靠的诊断生物标志物至关重要。然而，在癌症早期阶段，肿瘤含量很低，尤其是ctDNA。全局和局部特异性5hmC模式是很有希望的诊断生物标志物，因为这些表观基因组变化发生在肿瘤发生的早期，可以区分癌和非癌状态。

2022年Shao等人利用健康个体和膀胱癌、乳腺癌、结直肠癌、肾癌、肺癌或前列腺癌患者的cfDNA建立了泛癌5hmc基因模型，模型能够成功区分癌症和健康个体，在验证队列中表现优异（AUC = 91%，灵敏度= 68.6%，特异性= 96.6%）。检测早期疾病的表现也很高，在I期和II期疾病中，泛癌症敏感性分别为71.4%和81.3%，癌症特异性特征分别为89.3%和94.1%。

2024年Chang等人也开发了一种基于的cfDNA的5hmC分类器，能够区分I-III期结直肠癌患者和非癌症对照。基于96个5hmC基因体的模型在内部验证和外部验证中获得了94.3%和90.7%的AUC，检测性能优于经典的结直肠生物标志物癌胚抗原（CEA），其在内部和外部验证队列中的AUC分别为77.1%和73.2%。在90%的特异性下，基于5hmc的评分对I期和II/III期结直肠癌的敏感性分别为73.5%和85.3%，而CEA对相同分期的敏感性分别为29.4%和47.2%。同样，对肝细胞癌、肺癌和结直肠癌的研究也表明，基于5hmC的模型可以优于传统的诊断生物标志物，突出了5hmC在癌症检测中的潜力。

• DNA羟甲基化在癌症中的预后价值

在肝内胆管癌（ICC）中，2015年研究人员发现，与5hmC高/阳性水平相比，组织中5hmC水平低或阴性与肿瘤分期高、淋巴结转移多、总生存期短、无病生存期差相关。2024年，Kuang等人发现，在TET2和5hmC表达组合中，TET2−/5hmC−子宫内膜腺癌与最低的总生存率相关（p < 0.001）。相比之下，TET2+/5hmC+子宫内膜癌与细胞分化良好、子宫肌层侵袭最小、淋巴结转移阴性和肿瘤分期较低显著相关。多因素分析进一步表明，TET2/5hmC关系可能是子宫内膜癌的独立预后因素。

cfDNA中5hmC特征也可用于癌症预后或患者风险分层。在弥漫性大b细胞淋巴瘤（DLBCL）中，Chiu等人在2019年建立了基于29个基因的5hmC加权预后（wp）模型，该模型在预测无事件生存期（EFS）和OS方面达到了96%的准确性、86%的灵敏度和100%的特异性。与wp-评分低的患者相比，wp-评分高的患者的OS和EFS明显更差。值得注意的是，5hmC模型的敏感性、特异性和准确性优于现有的DLBCL预后因素，如乳酸脱氢酶水平升高、弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLCBL）活化和高国际预后指数。

2021年Cai等人使用cfDNA 5hmC标记和两种HCC蛋白生物标志物建立了肝细胞癌（HCC）评分。HCC评分高与HCC的临床病理预后因素（如微血管侵袭、肿瘤大小、肿瘤分期）呈正相关，且与高复发率、短无复发生存期、短OS显著相关。有趣的是，HCC评分也与实时肿瘤负荷动态呈正相关，提示其预测疾病复发的潜力。然而，这一发现受到研究样本小的限制。

总的来说，这些研究表明无细胞和基于组织的5hmC模式可以作为癌症预后的生物标志物。对这些5hmC模式的基因和通路的进一步研究将为导致预后不良风险的因素提供更深入的见解。

• 用5hmC预测化疗和免疫治疗反应

5hmC模式的改变可以用来预测患者对癌症治疗的反应。最近的研究揭示了5hmC表达水平与化疗反应之间的潜在关系。在弥漫性大B细胞淋巴瘤中，Chen等在2021证明，对化疗方案R-CHOP有反应和无反应的患者具有不同的5hmC谱。基于13个cfDNA 5hmC水平建立的logistic模型在验证队列中实现了78%的AUC， 82%的敏感性和75%的特异性，表明5hmC可以区分应答者和无应答者。在肝细胞癌（HCC）中，Guo等人（2023）证明5hmC的缺失通过组蛋白乙酰转移酶P300/ cbp相关因子(PCAF)/AKT轴诱导化疗耐药。他们发现，化疗耐药的HCC组织和细胞系总体5hmC和TET2表达水平显著降低，并与细胞分化不良和微血管侵袭增加相关。外源性过表达TET2后，全球5hmC水平恢复，细胞对化疗重新敏感。相反，化学敏感细胞中TET2的敲除降低了整体5hmC水平。

2024年，Shao等人开发了一种使用cfDNA中16个基因5hmC特征的预测模型，可以预测晚期非小细胞肺癌（NSCLC）患者的ICI结局。加权预测评分较低的患者与较长的中位生存期和较好的客观有效率显著相关。它们的无细胞5hmC特征也显示出比PD-L1肿瘤比例评分（TPS）更好的预测能力。Guler等人也研究了非小细胞肺癌中无细胞5hmC的动态变化，发现ICI应答者和无应答者的5hmC模式差异很大。

虽然还需要进一步的研究来充分了解5hmC在ICI治疗中的作用，但cfDNA 5hmC有望作为ICI反应的潜在预测因子。

• DNA羟甲基化的多组学分析

在非小细胞肺癌中，Hu等人开发了一种用于早期检测的5hmC和片段组学集成模型。使用37个cfDNA 5hmC基因和48个片段特征（不同窗口的短片段与长片段的比例）构建模型，将NSCLC患者与非癌症对照区分开来，并在两个验证队列中实现了86-94%的AUC， 83-88%的敏感性和78-90%的特异性。此外，该集成模型优于独立的5hmC和片段化模型，突出了片段组学长度与cfDNA 5hmC结合用于癌症检测的价值。在一项泛癌症研究中，Zhang等人建立了一个使用5hmC特征和多个cfDNA片段特征（包括大小、覆盖范围和首选末端）的诊断模型。研究模型具有较高的AUC值、敏感性和特异性，显示了整合5hmC和片段特征在癌症诊断中的潜力。整合的5hmC和片段组学模型也被研究用于其他癌症的早期检测。因此，5hmC与其它组学数据集的整合为增强当前的癌症生物标志物提供了机会，并加深了对5hmC模式和癌症研究的理解。

在过去的十年中，对羟甲基组的定量和分析取得了重大进展。早期的5hmC谱分析研究依赖于定量方法，如质谱法、薄层色谱法、高效液相色谱法（HPLC）、免疫测定法和光谱技术。虽然这些方法可以准确地量化5hmC水平，但它们的样品制备复杂性、高设备和试剂成本以及低分辨率使得它们在临床研究中难以普及。基于高通量测序的全基因组分析方法此时正蓬勃发展。下面列举一些主流的DNA羟甲基化检测方法。

• 基于亚硫酸氢盐测序

亚硫酸氢盐测序（BS-seq）是DNA甲基化分析的金标准方法，以单碱基分辨率提供全基因组评估。传统的BS-seq是用重亚硫酸盐处理DNA，将未修饰的胞嘧啶(C)、5fC和5caC脱氨为尿嘧啶(U)，并将5hmC转化为胞嘧啶-5-甲基磺酸（CMS），而5mC保持不变。由于5mC和CMS的最终读数都是胞嘧啶，因此BS-seq的一个关键限制是无法区分5mC和5hmC。为了克服这一障碍，可以在亚硫酸氢盐处理之前添加化学物质来保护或修饰碱基，从而能够更精确地区分甲基化状态。

氧化亚硫酸氢盐测序（OxBS-seq）和TET辅助亚硫酸氢盐测序（TAB-seq）是改进亚硫酸氢盐技术的改进。OxBS-seq利用过氧化剂（KRuO4）将5hmC氧化为5fC。由于5fC是一种不稳定的中间体，TDG和BER机制会将其转化回胞嘧啶，使其在亚硫酸盐处理后进行脱硝。与亚硫酸盐测序文库进行比较，可以鉴定出5hmC（“C”来自BS-seq，“T”来自OxBS-seq）。

另一方面，TAB-seq依靠T4噬菌体β-葡萄糖基转移酶（T4-βGT）将葡萄糖片段转移到5hmC上，保护其免受TET1氧化。经过氧化和亚硫酸盐处理后，可以直接鉴定5hmC。但这些技术存在一些局限性，比如需要大量的输入DNA (>100 ng)，这对cfDNA需求量过高；其次，这些检测需要很高的测序深度（>100倍的覆盖范围）；此外，由于OxBS-seq通常与BS-seq配对，需要两个文库进行5hmC鉴定，这种方法增加了成本。第三，亚硫酸氢盐处理是在极端条件下，有DNA降解的风险。

• 基于化学捕获和糖基化方法

葡萄糖基化是将葡萄糖片段通过T4-βGT转移到5hmC上的羟基上，形成葡萄糖基-5hmC （5ghmC）。葡萄糖分子可以被放射性标记用于定量，用于保护5hmC不被氧化，或用于将各种标签附着在5hmC上。例如，糖基化，高碘酸盐氧化，生物素化（GLIB）利用糖基化在高碘酸钠（NaIO4）氧化之前保护5hmC，接下来是生物素化和链霉亲和素珠捕获。代表性技术为5hmC-Seal技术，其在cfDNA液体活检具有一定应用潜力，因为它需要较少的DNA输入，并且可以有效地富集含有5hmc的片段，从而实现更具成本效益的测序。然而跟其它富集技术一样，5hmC-Seal无法实现5hmC位点的单碱基分辨率，一定程度限制了其量化5hmC水平的能力。

• 基于DNA脱氨法

AID/APOBEC酶为DNA脱氨提供了一种替代方法，绕过亚硫酸氢盐处理过程中产生的不稳定磺化中间体。该技术使用锌辅助因子脱氨单链DNA上的胞嘧啶，最先采用这种策略的是APOBEC偶联表观遗传测序（ACE-seq）。在ACE-seq中，5hmC首先被T4-βGT糖基化，以保护其免受APOBEC3A随后的降解。另一方面，5mC和其他未修饰的胞嘧啶在APOBEC3A处理后会被降解。ACE-seq的一个主要优势是它可以实现5hmC的单碱基分辨率定位，而DNA输入量比BS-seq少1000倍。此外还有单步脱氨测序（SSD-seq）是另一种脱氨技术，它利用一种特殊工程蛋白来脱氨胞嘧啶和5mC，但不脱氨5hmC。这些技术进一步提高了全基因组5hmC的检出，即使样品中5hmC含量较低，如人类癌细胞系和组织，也可以有效地检测到5hmC。

• 基于抗体的方法

5hmC或其衍生物特异性抗体也可用于捕获羟甲基化的DNA片段。羟甲基化DNA免疫沉淀（Hydroxymethylated DNA Immunoprecipitation, hmeDIP）利用单克隆抗5hmC抗体捕获并拉下羟甲基化DNA，已广泛应用于肿瘤组织和细胞系中5hmC的局部和全基因组谱分析。尽管基于抗体的谱分析技术受到抗体结合效率可变性的限制，并且可能偏向于超羟甲基化区域，但它们具有成本效益，易于实施，并且对5hmC具有高度特异性。因此该技术是研究羟甲基化的经典技术。

• 新兴的羟甲基化方法

除此之外，随着测序行业发展，也诞生了一些检测羟甲基化的新技术，比如单分子实时测序（SMRT），单细胞代谢物和标记测序（SIMPLE-seq）、Joint-snhmC测序等技术。

DNA羟甲基化作为癌症检测、预后和治疗反应预测的生物标志物具有很大的前景。分析方法的进步，特别是cfDNA方法的进步，使得研究羟甲基组的高灵敏度和特异性工具得以发展。通过将整合5hmC与其它多组学数据，这些发展将进一步得到加强，提供更全面的癌症机制视图，并有助于发现新的生物标志物和治疗靶点。