生物衰老贯穿整个生命周期的过程，通常被认为是细胞、组织和有机体水平上功能的持续衰退，例如，由DNA损伤的积累、端粒缩短、蛋白质稳态丧失或干细胞衰竭引起。因此，许多研究的重点是发现时间与各种分子数据之间的线性关系。由于衰老过程也涉及突变，例如，更年期或肠道神经元的丧失，线性模型可能过于简单，对非线性模型的更彻底的研究可能会对衰老的本质及其驱动力有新的认识。DNA甲基化(5mC)是表观遗传控制的重要一层。目前基于甲基化的表观遗传时钟经常使用线性回归模型构建，用于检测连续变化。然而与年龄有关的非线性变化还未见报道。
2024年4月9日，德国莱布尼茨衰老研究所的Steve Hoffmann团队在Nature communications上发表了题为“Nonlinear DNA methylation trajectories in aging male mice”的文章。该研究利用RRBS检测了DNA甲基化水平上衰老过程中的主要非线性变化，并基于非线性变化开发了一个表观遗传阶段时钟STageR(STage of aging estimatoR)，能够准确预测小鼠的不同表观遗传阶段。
文章信息与样本技术方法
结果展示
图1 雄性小鼠衰老过程中肠道DNA甲基化的动态变化
图2 研究中确定的所有19种甲基化轨迹
(a) 从上到下:饼状图显示特定集群中的胞嘧啶占所有aDMR胞嘧啶的比例; z-score展示了衰老过程中DNA甲基化变化；每个年龄组甲基化分布。红色阴影标记为进一步分析选择的集群。
(b) 从每个簇中获得的染色质片段进行富集。。
(c) 与五个代表性集群相关的基因中衰老基因集标记的富集。
(d) 非线性DNA甲基化变化的方案的提出，将生命分为三个阶段及其主要特征
(e) 集群C2、C3和C4相关的基因的基因本体(GO)分析。
图3 CpGs的DNA甲基化在公开可用的亚硫酸盐测序数据集中遵循非线性轨迹
上图，本研究中最丰富的非线性集群C2、C3和C4中CpGs的DNA甲基化。中图，感染和未感染肝螺杆菌的27周龄小鼠结肠样本的RRBS数据。红色箭头突出了两个实验条件之间的中间值的变化。下图，结肠衍生类器官的RRBS，从40日龄小鼠的开始培养，并按照标签所示的时间继续培养。
图4 衰老小鼠结肠中的非线性基因的表达变化
(a) 饼状图展示了与所有差异表达基因相比，特定基因集群内的基因比例(上图)。蓝色阴影集群表示年龄从早期到中年的转变，红色阴影集群表示年龄从中期到晚期的转变。
(b) 韦恩图展示了在年龄早期到中年或中期到晚期阶段，DNA甲基化变化和基因表达水平上发生相同类型转变的共有基因。
(c) 从b图所示的共有基因中中选出CpG数量最多的前5个基因，这些基因经历了早期到中年的转变(左)，或中期到晚期的转变(右)。每条平滑的线对应一个CpG。
(d) 根据DNA甲基化和基因表达水平的中晚期变化轨迹的基因集创建STRING蛋白质-蛋白质相互作用网络。在肠神经系统、肠屏障和/或结直肠癌中已知功能的基因被标记为特定的颜色。
（5）为了验证非线性甲基化轨迹在衰老过程中的存在，分析了来自不同动物（C57BL6/J小鼠）和不同测序设备的数据：包括3个月(n = 4)、7个月(n = 5)、12个月(n = 5)和27个月(n = 6)大的C57BL6/J小鼠。验证数据集证实了线性集群C1和C5以及描述早期到中年(C2和C3)和中期到晚期转变的非线性集群的趋势。
图5 外部队列数据集验证
(a) 在原始数据集和验证数据集中，衰老(aDMR) CpGs中差异甲基化区域之间存在重叠。
(b-f) 在原始数据集(左)和验证数据集(右)中不同年龄组的平均甲基组水平的分布和集群C1到C5的衰老过程中Z-score的轨迹变化。
（6）基于非线性变化的DNA甲基化变化集群，开发了一个的表观遗传阶段时钟STageR (STage of aging estimatoR)，即使使用一小部分数据，也可以捕获与衰老相关的DNA甲基化变化。STageR可以很容易地应用于其他数据集，即使只有小部分胞嘧啶集群。
图6 基于聚类的表观遗传阶段分类器 —— STageR
(a) 基于STageR的表观遗传阶段寿命预测流程。首先，识别输入数据集与非线性CpG聚类之间的重叠; 计算重叠CpGs的中位数DNA甲基化，显著地将特征空间的维数减少到3。STageR执行多项逻辑网络回归，并为衰老的三个表观遗传阶段分配概率。在条形图中，概率最高的阶段用红色突出显示。
(b) 模型中每个生命阶段的聚类在STageR的多项逻辑回归中的平均β系数。底部的面板显示了相关的z-score变化轨迹。
(c) 每个集群胞嘧啶次抽样数(x轴)的十倍交叉验证模型的误分误差，每个箱形图n = 100。
(d) 验证数据集的STageR预测。左:来自四个不同年龄组(x轴)的验证样本预测生命阶段的混淆矩阵(y轴)。右:所有验证样本(x轴)的生命阶段预测概率(y轴)。红色的方框围绕着最大概率的生命阶段。
(e) 对次采样数据进行STageR预测。当使用75、50、25和10%(从上到下)随机抽样的胞嘧啶时，混淆矩阵和预测概率。
(f) STageR对公开数据集的预测
总结
综上所述，利用RRBS研究了雄性小鼠结肠在五个不同衰老时间点的DNA甲基化变化轨迹，在早期到中年(3-9个月)和中期到晚期(15-24个月)的过渡中确定了两个表观基因组开关，将啮齿动物的生命根据DNA甲基化程度分为三个阶段。构建了一个能准确预测小鼠表观遗传年龄阶段的时钟分类器STageR，并在独立的小鼠队列和公开可用的数据集中证明了STageR时钟的普遍性
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