RRBS技术介绍
简化基因组甲基化测序(Reduced Representation Bisulfite Sequencing，RRBS)，通过MspI酶切富集基因组上的CpG岛、启动子、增强子等区域，并进行重亚硫酸盐测序的技术，从而实现在全基因组范围检测DNA甲基化。其数据具有以下特征：
酶切富集甲基化调控重要元件CG岛、启动子等; 同时可以检测基因body, 基因间区，重复序列元件; RRBS检测甲基化，类似WES检测突变。
队列研究、疾病分子分型、临床样本甲基化Biomarker筛选；
复杂疾病及肿瘤发病机制等甲基化研究；
模式动物发育和疾病甲基化研究；
动物及鱼类遗传育种及进化发育等研究。
RRBS技术原理
DNA提取：取适量的样本进行根据不同的方式进行基因组DNA 提取，获取高质量的基因组DNA。
转化质控：加入λ DNA（完全未甲基化的噬菌体DNA，用于监测重亚硫酸盐测序的转化效率）。
质量控制：使用Qubit 检测 DNA 样品浓度，琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 样品完整性，DNA质量合格才会进行文库构建。
酶切富集：取基因组DNA 进行 MspI 酶切富集CpG片段、末端修复、加“A”及连接甲基化修饰的接头。
盐转化：连接产物进行亚硫酸盐转化，将非甲基化碱基 C 转化成 U。
PCR扩增：转化产物连接标签进行扩增，扩增产物经过AMPure XP 进行片段选择, 通过Agilent 2100 和qPCR 对文库进行片段范围及有效浓度检测。
最后合格的文库在 Illumina HiSeq X10 或者Nova6000 上进行 DNA 文库测序，测序策略选择双端 150bp 测序。
RRBS数据质控
重亚硫酸盐转换率＞99%（基本质控）
酶切效率＞95%（非常重要）
RRBS技术优势
单碱基分辨率，金标准方案；
全基因组范围检测, 富集启动子/CpG岛甲基化调控区域等；
适合人和哺乳动物、动物及鱼类；
适合细胞、全血及新鲜冷冻组织等样本类型。
RRBS应用场景
甲基化谱建立
癌前病变到浸润性肺腺癌DNA甲基谱演变
研究方法：RRBS测序
研究样本：124例组织
研究结论：通过RRBS方案对124个手术切除样本(14个AAH, 非典型腺瘤性增生; 15个AIS, 原位腺癌; 22个MIA, 微侵袭性腺癌和11个ADC侵袭性腺癌及病灶旁样本)进行单碱基分辨率的甲基化测序。研究发现在晚期病变中甲基化变异逐渐增加，甲基化水平明显升高; 从甲基化变异推断的系统发育模式类似于基于体细胞突变的模式，表明DNA甲基化和体细胞突变的演化是平行的；DNA甲基化在肺腺癌早期癌变过程中对染色体不稳定性、突变和肿瘤免疫微环境的潜在影响。
DNA甲基化变化随癌前病变的进展而增加
疾病分子分型
基于血液甲基化无创诊断甲状腺结节
Blood leukocytes as a non-invasive diagnostic tool for thyroid nodules: a prospective cohort study. BMC Med. 2024
研究方法: RRBS测序
研究样本: 293份血液 （167份良性结节，126份恶性结节）
研究结论: 外周血DNA甲基化可用于甲状腺结节良恶性鉴别，有助于进行活检检查。
方案设计
甲基化机制研究
研究方法: RRBS、转录组测序
研究样本: 226例血液
研究结论：收集婴儿期、青少年期、成年期的正常及无菌小鼠的小肠上皮细胞，每组5个生物学重复，进行RRBS和RNA-seq测序；菌群依赖性的DNA甲基化差异在出生后早期即出现，并鉴定出126个DNA甲基化及RNA转录与菌群相关，通过TBS (Target Bisulfite Sequencing)和RTqPCR在独立样本（10个/组）中验证。
方案设计
RRBS送样要求
技术特点：不适合石蜡ffpe及血浆/血清cfDNA等。
艾斯基因
创建于2016年，隶属于国家高新技术企业和创新型中小企业。核心团队是国内最早一批表观多组学科研技术开拓者之一，在Nature、Cell等顶级期刊发表论文数十篇。公司全力打造赋能基础科研、精准医学及人群队列研究的 “创新多组学1+N” 技术服务体系，服务于每一个合作项目。每年为 70+海外和国内企业客户、200+ 高校和医院等客户提供 50000+ 例样本的技术服务。
