慢病毒载体(LVs)是逆转录病毒科的一个复杂亚类，已成为细胞和基因治疗中最常用的传递工具之一。在已经上市的20多种细胞和基因产品中，有7种是基于LVs的疗法[1]，且有更多的LVs产品出于申报的过程中。人们对LVs的兴趣日益增加，主要是因为它们具有转导增殖和非增殖细胞，并整合和传递基因表达的能力。与γ-逆转录病毒载体相比，它们提供了更安全的整合方式。LVs作为一种多功能包膜病毒工具脱颖而出，它可以用于治疗感染性疾病或遗传性疾病，同时还可以用于产生嵌合抗原受体(CAR)-T细胞用于癌症免疫治疗。
在慢病毒载体下游处理(DSP)过程中，LVs以其生物复杂性而闻名。病毒的稳定性通常会受到温度、离子强度、pH、冻解循环和剪切应力的影响。当pH值偏离7时，带有 VSV-G 包膜的LVs被观察到陆续失活[2]；当用1M NaCl处理时，其中50%的LVs功能滴度在1h 内丧失[3]。尽管在过去几年中，生产工艺取得了重大进展，但LV的生产和纯化远未达到其最大潜力。慢病毒日益提升的研究热度，增加了对稳健、可扩展和具有成本效益的工艺的需求，并期待更为稳健、高效的成熟工艺的出现。
切向流过滤(TFF)技术是一种采用超滤/洗滤(UF/DF)模式的操作模式，经常被应用于生物制药中。TFF技术能够去除低分子量杂质同时保留目的颗粒，还允在低压操作过程中进行料液浓缩和缓冲液交换。TFF技术可被用于LVs的下游工艺中（如下图黄色区域）。使用TFF技术能将LVs料液体积浓缩，并将滴度提高到10-30倍，并缩小下游处理体积。其次，TFF技术可将层析后的LVs料液高效置换到冻存Buffer中，这对维持LVs在冻融期间的稳定性很重要。
TFF耗材的类型和工艺参数需要根据进料情况进行优化。影响料液最终收率和HCP去除效果的因素往往有以下几个方面：膜介质、膜孔径、剪切力以及工艺参数（如切向流速，跨膜压力等）。
膜介质的类型的不同决定了在实现TFF过程中流体流动方式。常见的膜介质可分为卡片式膜包和中空纤维柱。中空纤维柱通常由薄壁中空纤维管、外壳和连接模块组成。在切向流过滤过程时，大颗粒物质在纤维管内保存，小颗粒的物质通过管壁间隙渗透出管外，实现低分子量杂质的去除。中空纤维柱结构简单，剪切力易计算，且在相同的进口流量下剪切力低，往往被应用于对剪切力敏感的物料处理中。
图1 中空纤维超滤过程中流体示意图
在膜孔径的选择中，虽然较大的孔可以提供更好的杂质去除和通量性能，但如果孔径大小与载体相似，则载体也能被膜介质吸附或被困在膜表面。因此，100-750kDa范围内的膜材往往被应用于LVs的超滤浓缩和缓冲液置换步骤。
在使用中空纤维柱进行超滤的过程中，剪切力首先来自于进口流速（Feed Flux）。LVs的最外层为脂蛋白包膜，包膜结构的存在决定了LVs对剪切力敏感。2000-3570-s的剪切下的进口流速（Feed Flux）被应用于LVs的超滤和洗滤步骤中。
作为明星产品，赛多利斯中空纤维柱使用了具有防污、低融合性的聚醚砜超滤膜（m-PES）制作中空纤维。这款产品具有独特的化学性薄膜和纺纱技术，用以保证其坚固和严格的规格。
图2 赛多利斯系列中空纤维柱
其中，赛多利斯750KD中空纤维柱有幸参与了客户LVs的下游工艺开发，并取得了理想的效果。使用750KD在处理1200ml 2.48E+07 TU/ml LVs料液，经过浓缩、10倍洗滤后和1次顶洗后，LVs总收率为97.99%，最终获得4.62 E+08 TU/ml的料液。TFF过程中各步骤的感染滴度回收率详见下图
图3 赛多利斯750KD各步骤感染滴度回收率
在整个处理中，赛多利斯750KD中空纤维柱透过流量（Flux，LMH）并无明显锐减，且压差（△P）最大值仅为0.1Bar，过程中TMP得到了稳定的控制。
图4 赛多利斯750KD中空纤维柱透过流量与TMP曲线
LVs的料液通常会含有＞300μg/ml的HCP，这对下游的纯化提出了挑战。在本次测试中，赛多利斯750KD中空纤维柱在293T HCP的去除能力上也有优异的表现（如图5）
图 5 750KD各步骤 293T HCP总去除率
起始料液（Before UF）LVs料液的293 HCP为495.28μg/ml，经过750KD 10倍洗滤后，293T HCP的总去除率为98.53%。处理后的LVs料液结合层析技术（如Sartorbind Q膜层析），293T HCP终浓度<5.55μg/ml。750KD中空纤维柱为下一步层析奠定了良好的基础。
综上所述，赛多利斯750KD中空纤维处理LVs料液，在浓缩和洗滤阶段滤速平稳，并可以实现约98%的回收率，整个超滤过程中感染滴度回收率大于80%；HCP总去除率大于98%。
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[1] Fatemeh Arabi, Vahid Mansouri, Naser Ahmadbeigi Gene therapy clinical trials, where do we go? An overview Biomedicine & Pharmacotherapy2022,153
[2] Higashikawa, F.; Chang, L.J. Kinetic analyses of stability of simple and complex retroviral vectors. Virology 2001, 280, 124–131.
[3] Segura, M.D.L.M.; Garnier, A.; Kamen, A. Purification and characterization of retrovirus vector particles by rate zonal ultracentrifugation. J. Virol. Methods 2006, 133, 82–91
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