引 言
双特异性抗体（bispecific antibody，BsAb），简称双抗，主要通过基因工程改造的CHO等哺乳细胞进行表达。在双抗药物的开发中，大部分的抗体分子被设计成2种不同抗原结合臂，能分别结合靶抗原和效应细胞或双靶点，发挥介导免疫细胞杀伤或双靶点信号阻断作用，创造了新的基本治疗作用机制，是抗体药物的研究热点。
传统的补料培养（Fed-batch）是目前抗体及其它治疗性蛋白的常见生产模式。灌流培养（Perfusion）通过使用新鲜的培养基置换代谢副产物，使细胞在稳定的微环境中持续表达，动态实时收获抗体；在增加双抗产量的同时，减少双抗聚体和电荷变异体产生，最终提升双抗分子的质量和产量，达到降本增效的目的（强化工艺|一站式灌流工艺开发攻略，请查收）。据Gomez,N,Barkhordarian,H,Lull,J 报道，使用灌流模式显著降低了双抗的聚体产生，并将双抗单体产量增加了4-5倍。
基于市场双抗对灌流工艺的需求，Sartorius成立了专项小组，针对双抗进行灌流工艺的开发以及放大。具体流程如下（图1），Step1为使用4Cell®SmartCHO和4Cell®SmartCHO pe培养基，在Ambr®250 HT微型反应器上进行灌流工艺开发；Step2在Biostat® B 2L反应器上进行灌流工艺放大，为中试工艺培养提供小试数据支持。本文章主要分享Biostat® B 2L反应器灌流工艺放大过程及结果。
图1 双抗灌流工艺开发步骤
实验设计及结果
01
实验设计
本研究将前期Ambr®250 HT优化后的参数在Biostat® B 2L反应器上进行了放大研究。采用的为稳态灌流培养，培养时间为20天，CSPR(Cell specific perfusion rate，细胞特异性灌流速率)维持在45 pL/cell/day，培养体积从200mL放大到1L，依据P/V结合Kla原则进行放大。两者的主要培养参数如下表。
表 灌流培养工艺参数
02
细胞生长分析
经Biostat® B 2L反应器放大培养后，在培养20天下，细胞培养密度维持60E+06 Cells/ml可达 12天，细胞活率维持在90%以上，CSPR控制在45 pL/cell/day，与前期Ambr® 250 HT所呈现的活细胞密度和细胞活率均可比。
图2 两种培养规格下的细胞密度和活率
03
生化分析
在控制相同细胞密度、使用相同培养基和CSPR的灌流速率下，通过分析葡萄糖（Glucose）和L-谷氨酰胺（L-Gln）残留，能够反应细胞生长过程中对两者的利用效率。氨（NH4+）和乳酸（Lactate）是细胞培养过程中不可避免的两种代谢副产物。NH4+主要来自于氨基酸、谷氨酰胺等的代谢降解和自发降解；Lactate主要来源于葡萄糖的不完全氧化。通过分析CHO细胞生长中的NH4+和Lactate残留能够反应细胞的氨基酸和糖代谢是否正常。
在Biostat® B 2L生物反应器放大培养过程中，Glucose和L-Gln的残留量与Ambr® 250 HT具有相同的趋势（如图3）。Day 10后，Biostat® B 2L生物反应器Glucose和L-Gln的残留量更少，Glucose和L-Gln有效参与了细胞的生长代谢中，得到了更好的应用。Lactate低残留量也有效印证了氧气传质良好，Glucose在培养过程中被有效利用。且Biostat® B 2L生物反应器培养过程中NH4+残留量与Ambr® 250 HT培养过程中的残留量表现一致（如图3），氨基酸和L-Gln的代谢正常。
图3 两种培养规格下的生化分析
04
产量分析
在Biostat® B 2L和Ambr® 250 HT两种反应器下进行灌流培养时，均采用0.2μm中空纤维柱进行双抗中间体收获，细胞控制密度和ATF工艺参数保持一致。两种规格下，每天双抗收获浓度趋向一致（如图4），达到了实验设定的目标。
图4 两种培养规模下的双抗收获浓度
05
Perfusion与Fed-batch的对比
在本次实验中，研究团队也将Biostat® B 2L Perfusion模式与对照组Biostat® B 2L Fed-batch培养进行了对比。Perfusion模式表现了一定的优越性：其IVCD(integral of viable cell density，活细胞密度积分)为813.4E+06 cells day/mL，是Fed-batch培养的4倍；双抗总Titer为31.07g，是后者（5.2g）的6倍（详见图5）。若将整个培养计入统计范围，灌流模式的Qp（Specific Productivity，细胞比生产率）为40.51 pg/cell/day大约是Fed-batch的2倍。由此可见，对比Fed-batch培养，灌流培养能够收获更多的双抗总量，同时还能获得更高的细胞比生产率，是双抗生产的理想工艺路线。
图5 Perfusion和Fed-batch的工艺对比
小 结
在前期Ambr® 250 HT培养基筛选、培养参数优化的基础上，Sartorius的工艺开发团队并将其成功放大到了Biostat® B 2L反应器中，在控制相同的细胞密度、使用相同的培养基和CSPR的灌流速率下，Biostat® B 2L反应器在放大过程中，CHO细胞密度和活率均获得了大体积呈现。
在细胞代谢方面，Biostat® B 2L反应器放大培养中的Glucose、L-Gln、NH4+和Lactate残留趋势与Ambr® 250 HT保持一致，且后期提高了能量物质的利用率。在细胞控制密度和ATF工艺参数保持一致的工艺条件下，Biostat® B 2L反应器放大培养保持了相似的双抗的收获浓度，因此放大成功。证实了灌流培养用于双抗生产的可行性。在后期Biostat® B 2L Fed-batch培养对比实验中，也表明灌流培养对比Fed-batch培养具有更高的单细胞和批产物生产能力，是一种先进的工艺技术路线。具有提高产能，增加产品稳定性，降低成本的优势，是双抗分子未来的生产趋势。
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