引言
前面我们介绍了灌流条件下单抗的下游膜纯化平台，在此基础上，赛多工艺开发团队又通过膜纯化技术搭建了双抗下游纯化工艺平台。
双抗相较与单抗而言，纯化挑战和难度更大.本文通过双抗灌流培养工艺条件下的纯化应用研究，建立了亲和、阴离子交换、阳离子交换三步膜层析工艺以及膜分离工艺，并将各工艺进行有序衔接，搭建了高效且符合工艺要求的双抗下游“膜纯化”平台。
实验设计与方法
双抗下游整体工艺设计如下：
采用10ml Sartobind®Rapid A亲和膜层析进行抗体粗纯捕获，具体方案参数见表1：
表1 Sartobind®Rapid A亲和层析方案参数表
经过抗体低pH条件下的稳定性研究，灭活条件设定为：pH3.5 ，灭活时间1h。
该步采用流穿模式，用10ml Sartobind®Q去除大部分HCP、HCD等杂质。经过前期载量测试和纯化条件摸索，该步工艺参数见表2：
表2 Sartobind®Q 阴离子交换层析方案参数表
因双抗收获液通常含有同源二聚体，属于产品相关杂质，需要去除，该步用3ml Sartobind®S 通过吸附-洗脱模式拟去除双抗中的同源二聚体，同时进一步去除HCP、HCD、聚合物等杂质。经过前期载量测试和纯化条件摸索，工艺参数如下：
表3 Sartobind®S 阳离子交换层析方案参数表
以Virosart®HF为除病毒滤器（Virosart ®Max 作为预过滤器），在恒压2bar下进行除病毒过滤。
用Hydrosart® 30KD超滤膜包对除病毒后的双抗进行超滤浓缩。经TMP优化，操作参数如下：
表4 Hydrosart ®30KD 超滤工艺参数
用sartopore2 0.2um滤器在1bar压力下对抗体进行恒压过滤。
本研究中，分别选取收获液、亲和洗脱样品、低pH灭活过滤后样品分别在26℃、4℃条件下放置3-10天。通过检测SEC-HPLC和CEX-HPLC检测其稳定性。依据各步骤蛋白稳定性及各工艺处理效率来决定料液合并频次以及各步纯化处理频次
实验结果与讨论
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层析图谱（叠加处理后）
图1-1 不同“亚批”层析图谱
图1-2 某一亚批6次循环图谱
针对灌流过程中不同时间下罐的收获液，使用Rapid A 亲和层析图谱如图1-1，上样载量随不同“亚批”收获液蛋白量变化略有不同，但洗脱曲线趋于一致。体现了Rapid A 不同批次使用的稳定性。另由图 1-2可知，在相同料液，相同载量下，层析曲线完全一致，体现了Rapid A 在多次重复循环模式下的工艺稳定性。
质量及收率指标
从质量指标来看，经过Rapid A 捕获后，SEC-HPLC纯度约99%左右，HCP和HCD在可控范围内，残留Protein A 杂质含量在药典限定范围内。为后续层析提供了便利条件。
另外CEX-HPLC检测酸性峰比例为31.5%，后经质谱检测主要为同源二聚体，需要进一步通过精纯手段去除。
2
Sartobind®Q 层析图谱
图2 Sartobind®Q层析图谱
Sartobind®Q 质量及收率指标
综合Sartobind®Q膜层析图谱和质量及收率指标可得：该膜在1Kg/L的载量下，仍有较强的HCP、HCD去除能力. 同时具有较高的回收率。且在10MV/min流速下，膜层析能处理600CV/h，其处理量及处理效率亦要远优于传统填料。
3
层析图谱
图3 Sartobind®S层析图谱（PS：第一个洗脱峰为酸峰，主要为同源二聚体。第二个洗脱峰为目的蛋白峰）
质量指标
综合图谱和质量指标可得：经过Sartobind®S膜层析精纯，CEX-HPLC酸性峰比例由30.3%降至4.1%，主峰面积亦由64.8%提高至92%。且HCP、HCD等杂质含量进一步降低。
经过三步膜层析后，抗体纯度、杂质含量指标完全满足药典及工艺要求。Sartobind®Rapid A、Sartobind®Q、Sartobind®S 膜层析在双抗中有着很好的工艺应用。
4
过滤曲线如下:
图4 除病毒过滤曲线图
由图可得：整个过滤过程中流速稳定，过滤结束时载量1500L/m2，（此时质量载量>1.16Kg/m2），此载量仍有较大安全余量。完全满足工艺要求。
5
超滤流速和收率结果如下：
从上表可以看出：该超滤步骤流速满足工艺要求，水通量恢复率亦较高。为膜包多次重复使用提供了理论依据。
除菌过滤采用Sartopore® 2 除菌滤器，过滤平均流速1000LMH@1Bar。实现了高流速与高载量。
6
稳定性考察结果显示收获液和亲和洗脱样品在26℃ 3天内均维持稳定。深层过滤后样品在4℃下10天内维持稳定。因此在该灌流模式下，收获液室温下理论可三天合并一次做亲和捕获。亲和洗脱样品也可放置三天，深层过滤及后续层析样品理论可在10天内合并处理
依据稳定性考察结果同时结合生产实际，工艺顺序可设计如下：
表5 下游各步骤衔接时间计划示意图
上表设计中，上游灌流每天进行收获液收集，Rapid A 每“亚批次”处理三天的收获液。Low pH每次紧随Rapid A 处理。Sartobind Q 因其载量大可每次处理两个“亚批次”的Low pH后样品（根据中间品稳定性数据，Sartobind Q 亦可处理更长周期的Low PH样品）。考虑到膜层析流速快的特点，可将Sartobind S 与Sartobind Q在同一天处理相同“亚批”的料液。VFF,TFF,终端除菌过滤放在原液纯化最后一天处理。处理频率可与前序步骤相同。（亦可将不同亚批的层析后混和样品）。
以上设计为参考设计，根据料液稳定性，其并非唯一设计，亦可参考前期介绍的单抗的下游膜纯化平台设计方式。这也体现了膜层析和膜分离最为纯化手段的高效性和灵活性。
小结
本研究通过创新型膜层析技术与膜分离技术的开发应用，建立了灌流培养条件下双抗下游纯化整体工艺平台。该工艺平台纯化效率高，层析流速达5~10CV/min。且SEC-HPLC纯度>99%、IEX-HPLC主峰比例>92%. HCP、HCD、残留protein A等杂质含量符合原液要求。
针对双抗灌流培养连续收获的特性，在工艺开发基础上，结合料液稳定性及膜层析高流速、高载量、便于快速多次使用特点，实际生产中各工序时间计划也可根据实际情况组合安排，有很大弹性空间。这大大提高了灌流条件下的纯化效率，为双抗下游中试及商业化生产工艺提供了参考借鉴。
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